El diagnòstic diferencial dels nòduls pulmonars identificats per tomografia computada (TC) segueix sent un repte en la pràctica clínica.Aquí, caracteritzem el metaboloma global de 480 mostres de sèrum, incloent controls sans, nòduls pulmonars benignes i adenocarcinoma pulmonar en estadi I.Els adenocarcinomes presenten perfils metabolòmics únics, mentre que els nòduls benignes i els individus sans tenen una gran similitud en els perfils metabolòmics.Al grup de descobriment (n = 306), es va identificar un conjunt de 27 metabòlits per diferenciar entre nòduls benignes i malignes.L'AUC del model discriminant en els grups de validació interna (n = 104) i validació externa (n = 111) va ser de 0,915 i 0,945, respectivament.L'anàlisi de la via va revelar un augment dels metabòlits glicolítics associats a una disminució del triptòfan en el sèrum d'adenocarcinoma pulmonar en comparació amb nòduls benignes i controls sans, i va suggerir que la captació de triptòfan afavoreix la glucòlisi a les cèl·lules canceroses de pulmó.El nostre estudi destaca el valor dels biomarcadors de metabòlits sèrics per avaluar el risc de nòduls pulmonars detectats per TC.
El diagnòstic precoç és fonamental per millorar les taxes de supervivència dels pacients amb càncer.Els resultats del National Lung Cancer Screening Trial (NLST) dels EUA i l'estudi europeu NELSON han demostrat que el cribratge amb tomografia computada de dosis baixes (LDCT) pot reduir significativament la mortalitat per càncer de pulmó en grups d'alt risc1,2,3.Des de l'ús generalitzat de la LDCT per al cribratge del càncer de pulmó, la incidència de troballes radiològiques incidentals de nòduls pulmonars asimptomàtics ha continuat augmentant 4 .Els nòduls pulmonars es defineixen com a opacitats focals de fins a 3 cm de diàmetre 5 .Ens enfrontem a dificultats per avaluar la probabilitat de malignitat i fer front al gran nombre de nòduls pulmonars detectats incidentalment a la LDCT.Les limitacions de la TC poden conduir a exàmens de seguiment freqüents i resultats falsos positius, donant lloc a una intervenció innecessària i un tractament excessiu6.Per tant, cal desenvolupar biomarcadors fiables i útils per identificar correctament el càncer de pulmó en les primeres etapes i diferenciar la majoria dels nòduls benignes en la detecció inicial 7 .
L'anàlisi molecular exhaustiva de la sang (sèrum, plasma, cèl·lules mononuclears de sang perifèrica), incloent la genòmica, la proteòmica o la metilació de l'ADN8,9,10, ha donat lloc a un interès creixent en el descobriment de biomarcadors de diagnòstic per al càncer de pulmó.Mentrestant, els enfocaments de la metabolòmica mesuren els productes finals cel·lulars que estan influenciats per accions endògenes i exògenes i, per tant, s'apliquen per predir l'inici i el resultat de la malaltia.La cromatografia líquida-espectrometria de masses en tàndem (LC-MS) és un mètode àmpliament utilitzat per als estudis de metabolòmica a causa de la seva alta sensibilitat i gran rang dinàmic, que pot cobrir metabòlits amb diferents propietats fisicoquímiques11,12,13.Tot i que s'ha utilitzat l'anàlisi metabolòmica global de plasma / sèrum per identificar biomarcadors associats al diagnòstic del càncer de pulmó14,15,16,17 i l'eficàcia del tractament,18 els classificadors de metabòlits sèrics per distingir entre nòduls pulmonars benignes i malignes encara s'han d'estudiar molt.-Recerca massiva.
L'adenocarcinoma i el carcinoma de cèl·lules escamoses són els dos subtipus principals de càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC).Diverses proves de cribratge de TC indiquen que l'adenocarcinoma és el tipus histològic més comú de càncer de pulmó1,19,20,21.En aquest estudi, hem utilitzat cromatografia líquida d'ultra rendiment-espectrometria de masses d'alta resolució (UPLC-HRMS) per realitzar anàlisis metabolòmiques en un total de 695 mostres de sèrum, inclosos controls sans, nòduls pulmonars benignes i TC detectats ≤3 cm.Detecció d'adenocarcinoma pulmonar en estadi I.Hem identificat un panell de metabòlits sèrics que distingeixen l'adenocarcinoma pulmonar dels nòduls benignes i els controls sans.L'anàlisi d'enriquiment de la via va revelar que el metabolisme anormal del triptòfan i la glucosa són alteracions comunes en l'adenocarcinoma pulmonar en comparació amb nòduls benignes i controls sans.Finalment, vam establir i validar un classificador metabòlic sèric amb alta especificitat i sensibilitat per distingir entre nòduls pulmonars malignes i benignes detectats per LDCT, que pot ajudar en el diagnòstic diferencial precoç i l'avaluació del risc.
En l'estudi actual, es van recollir mostres de sèrum coincidents per sexe i edat de manera retrospectiva de 174 controls sans, 292 pacients amb nòduls pulmonars benignes i 229 pacients amb adenocarcinoma pulmonar en estadi I.Les característiques demogràfiques dels 695 subjectes es mostren a la taula complementària 1.
Tal com es mostra a la figura 1a, es van recollir un total de 480 mostres de sèrum, incloses 174 mostres de control saludable (HC), 170 nòduls benignes (BN) i 136 mostres d'adenocarcinoma de pulmó (LA) en etapa I, al Centre de càncer de la Universitat de Sun Yat-sen.Cohort de descobriment per a perfils metabolòmics no dirigits mitjançant cromatografia líquida d'ultra rendiment-espectrometria de masses d'alta resolució (UPLC-HRMS).Tal com es mostra a la figura suplementària 1, es van identificar metabòlits diferencials entre LA i HC, LA i BN per establir un model de classificació i explorar encara més l'anàlisi de la via diferencial.104 mostres recollides pel Sun Yat-sen University Cancer Center i 111 mostres recollides per altres dos hospitals van ser sotmeses a validació interna i externa, respectivament.
Una població d'estudi a la cohort de descobriments que es va sotmetre a una anàlisi de metabolòmica sèrica global mitjançant cromatografia líquida d'ultra rendiment-espectrometria de masses d'alta resolució (UPLC-HRMS).b Anàlisi discriminant de mínims quadrats parcials (PLS-DA) del metaboloma total de 480 mostres de sèrum de la cohort d'estudi, inclosos controls sans (HC, n = 174), nòduls benignes (BN, n = 170) i adenocarcinoma pulmonar en estadi I. (Los Angeles, n = 136).+ESI, mode d'ionització electrospray positiu, -ESI, mode d'ionització electrospray negatiu.c–e Els metabòlits amb abundàncies significativament diferents en dos grups donats (test de classificació de Wilcoxon de dues cues, valor p ajustat de la taxa de descobriment fals, FDR <0, 05) es mostren en vermell (canvi de vegades > 1,2) i blau (canvi de vegades <0,83) .) es mostra al gràfic del volcà.f Mapa de calor de agrupació jeràrquica que mostra diferències significatives en el nombre de metabòlits anotats entre LA i BN.Les dades font es proporcionen en forma de fitxers de dades font.
El metaboloma sèric total de 174 HC, 170 BN i 136 LA del grup de descobriment es va analitzar mitjançant l'anàlisi UPLC-HRMS.Primer mostrem que les mostres de control de qualitat (QC) s'agrupen fortament al centre d'un model d'anàlisi de components principals (PCA) no supervisat, confirmant l'estabilitat del rendiment de l'estudi actual (figura suplementària 2).
Tal com es mostra a l'anàlisi parcial de mínims quadrats-discriminants (PLS-DA) a la figura 1b, vam trobar que hi havia diferències clares entre LA i BN, LA i HC en els modes d'ionització d'electroespray positiu (+ESI) i negatiu (-ESI). .aïllat.Tanmateix, no es van trobar diferències significatives entre BN i HC en condicions + ESI i -ESI.
Hem trobat 382 trets diferencials entre LA i HC, 231 trets diferencials entre LA i BN i 95 trets diferencials entre BN i HC (test de rang signat de Wilcoxon, FDR <0,05 i canvi múltiple >1,2 o <0,83) (Figura .1c-e). )..Els pics es van anotar més (dades suplementàries 3) en una base de dades (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) pel valor m/z, el temps de retenció i la cerca d'espectre de masses de fragmentació (detalls descrits a la secció Mètodes) 22 .Finalment, es van identificar 33 i 38 metabòlits anotats amb diferències significatives d'abundància per a LA versus BN (figura 1f i taula suplementària 2) i LA versus HC (figura suplementària 3 i taula suplementària 2), respectivament.En canvi, només es van identificar 3 metabòlits amb diferències significatives d'abundància en BN i HC (Taula suplementària 2), d'acord amb la superposició entre BN i HC a PLS-DA.Aquests metabòlits diferencials cobreixen una àmplia gamma de productes bioquímics (figura suplementària 4).En conjunt, aquests resultats demostren canvis significatius en el metaboloma sèric que reflecteixen la transformació maligna del càncer de pulmó en fase inicial en comparació amb nòduls pulmonars benignes o subjectes sans.Mentrestant, la similitud del metaboloma sèric de BN i HC suggereix que els nòduls pulmonars benignes poden compartir moltes característiques biològiques amb individus sans.Atès que les mutacions del gen del receptor del factor de creixement epidèrmic (EGFR) són freqüents en el subtipus 23 de l'adenocarcinoma pulmonar, es va intentar determinar l'impacte de les mutacions del conductor en el metaboloma sèric.A continuació, es va analitzar el perfil metabolòmic global de 72 casos amb estat d'EGFR en el grup d'adenocarcinoma pulmonar.Curiosament, vam trobar perfils comparables entre pacients mutants EGFR (n = 41) i pacients de tipus salvatge EGFR (n = 31) a l'anàlisi PCA (figura suplementària 5a).Tanmateix, vam identificar 7 metabòlits l'abundància dels quals es va alterar significativament en pacients amb mutació EGFR en comparació amb pacients amb EGFR de tipus salvatge (prova t, p <0, 05 i canvi de vegades> 1, 2 o < 0, 83) (figura suplementària 5b).La majoria d'aquests metabòlits (5 de cada 7) són acilcarnitines, que tenen un paper important en les vies d'oxidació dels àcids grassos.
Tal com s'il·lustra al flux de treball que es mostra a la figura 2a, es van obtenir biomarcadors per a la classificació dels nòduls mitjançant operadors de contracció mínima absoluta i selecció basada en 33 metabòlits diferencials identificats a LA (n = 136) i BN (n = 170).Millor combinació de variables (LASSO) – model de regressió logística binària.Es va utilitzar una validació creuada deu vegades per provar la fiabilitat del model.La selecció de variables i la regularització dels paràmetres s'ajusten mitjançant una penalització de maximització de probabilitat amb el paràmetre λ24.L'anàlisi de metabolòmica global es va realitzar de manera independent en els grups de validació interna (n = 104) i validació externa (n = 111) per provar el rendiment de classificació del model discriminant.Com a resultat, es van identificar 27 metabòlits del conjunt de descobriments com el millor model discriminant amb el valor mitjà d'AUC més gran (Fig. 2b), entre els quals 9 tenien una activitat augmentada i 18 una activitat disminuïda a LA en comparació amb BN (Fig. 2c).
Flux de treball per construir un classificador de nòduls pulmonars, inclosa la selecció del millor panell de metabòlits sèrics del conjunt de descobriments mitjançant un model de regressió logística binari mitjançant una validació creuada deu vegades i l'avaluació del rendiment predictiu en conjunts de validació interna i externa.b Estadístiques de validació creuada del model de regressió LASSO per a la selecció de biomarcadors metabòlics.Els números indicats anteriorment representen el nombre mitjà de biomarcadors seleccionats en un determinat λ.La línia de punts vermella representa el valor mitjà d'AUC a la lambda corresponent.Les barres d'error grises representen els valors AUC mínim i màxim.La línia de punts indica el millor model amb els 27 biomarcadors seleccionats.AUC, àrea sota la corba de la característica operativa del receptor (ROC).c Canvis de doblega de 27 metabòlits seleccionats del grup LA en comparació amb el grup BN del grup de descobriment.Columna vermella - activació.La columna blava és un descens.d–f Corbes de característiques operatives del receptor (ROC) que mostren la potència del model discriminant basat en 27 combinacions de metabòlits en els conjunts de validació de descobriment, intern i extern.Les dades font es proporcionen en forma de fitxers de dades font.
Es va crear un model de predicció basat en els coeficients de regressió ponderats d'aquests 27 metabòlits (taula suplementària 3).L'anàlisi ROC basada en aquests 27 metabòlits va produir un valor d'àrea sota la corba (AUC) de 0,933, la sensibilitat del grup de descobriment va ser de 0,868 i l'especificitat va ser de 0,859 (Fig. 2d).Mentrestant, entre els 38 metabòlits diferencials anotats entre LA i HC, un conjunt de 16 metabòlits va aconseguir un AUC de 0, 902 amb una sensibilitat de 0, 801 i una especificitat de 0, 856 en discriminar LA de HC (figura suplementària 6a-c).També es van comparar els valors d'AUC basats en diferents llindars de canvi de plecs per als metabòlits diferencials.Vam trobar que el model de classificació va funcionar millor a l'hora de discriminar entre LA i BN (HC) quan el nivell de canvi de plec es va establir en 1,2 versus 1,5 o 2,0 (figura suplementària 7a, b).El model de classificació, basat en 27 grups de metabòlits, es va validar encara més en cohorts internes i externes.L'AUC va ser de 0,915 (sensibilitat 0,867, especificitat 0,811) per a la validació interna i 0,945 (sensibilitat 0,810, especificitat 0,979) per a la validació externa (Fig. 2e, f).Per avaluar l'eficiència interlaboratori, es van analitzar 40 mostres de la cohort externa en un laboratori extern tal com es descriu a la secció Mètodes.La precisió de classificació va aconseguir un AUC de 0,925 (figura suplementària 8).Com que el carcinoma de cèl·lules escamoses de pulmó (LUSC) és el segon subtipus més comú de càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC) després de l'adenocarcinoma de pulmó (LUAD), també hem provat la utilitat potencial validada dels perfils metabòlics.BN i 16 casos de LUSC.L'AUC de discriminació entre LUSC i BN va ser de 0,776 (figura suplementària 9), cosa que indica una capacitat més pobra en comparació amb la discriminació entre LUAD i BN.
Els estudis han demostrat que la mida dels nòduls a les imatges de TC està positivament correlacionada amb la probabilitat de malignitat i segueix sent un determinant important del tractament dels nòduls25,26,27.L'anàlisi de les dades de la gran cohort de l'estudi de cribratge NELSON va mostrar que el risc de malignitat en subjectes amb ganglis <5 mm era fins i tot similar al dels subjectes sense ganglis 28 .Per tant, la mida mínima que requereix un seguiment periòdic de TC és de 5 mm, tal com recomana la British Thoracic Society (BTS), i de 6 mm, tal com recomana la Fleischner Society 29 .No obstant això, els nòduls de més de 6 mm i sense característiques benignes evidents, anomenats nòduls pulmonars indeterminats (IPN), segueixen sent un repte important en l'avaluació i gestió en la pràctica clínica30,31.A continuació, vam examinar si la mida dels nòduls va influir en les signatures metabolòmiques mitjançant mostres agrupades de les cohorts de descobriment i validació interna.Centrant-nos en 27 biomarcadors validats, primer vam comparar els perfils PCA dels metabolomes HC i BN sub-6 mm.Vam trobar que la majoria dels punts de dades d'HC i BN es superposaven, demostrant que els nivells de metabòlits sèrics eren similars en ambdós grups (Fig. 3a).Els mapes de característiques de diferents rangs de mida es van mantenir conservats a BN i LA (Fig. 3b, c), mentre que es va observar una separació entre nòduls malignes i benignes en el rang de 6-20 mm (Fig. 3d).Aquesta cohort tenia un AUC de 0,927, una especificitat de 0,868 i una sensibilitat de 0,820 per predir la malignitat de nòduls de 6 a 20 mm (Fig. 3e, f).Els nostres resultats mostren que el classificador pot capturar els canvis metabòlics causats per la transformació maligna primerenca, independentment de la mida del nòdul.
ad Comparació de perfils de PCA entre grups especificats a partir d'un classificador metabòlic de 27 metabòlits.CC i BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.en LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm i LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e Corba de la característica operativa del receptor (ROC) que mostra el rendiment del model discriminant per als nòduls de 6–20 mm.f Els valors de probabilitat es van calcular a partir del model de regressió logística per a nòduls de 6 a 20 mm.La línia de punts grisos representa el valor de tall òptim (0,455).Les xifres anteriors representen el percentatge de casos previst per a Los Angeles.Utilitzeu una prova t de Student de dues cues.PCA, anàlisi de components principals.Àrea AUC sota la corba.Les dades font es proporcionen en forma de fitxers de dades font.
Es van seleccionar quatre mostres (entre 44 i 61 anys) amb mides similars de nòduls pulmonars (7-9 mm) per il·lustrar el rendiment del model de predicció de malignitat proposat (Fig. 4a, b).En el cribratge inicial, el cas 1 es presentava com un nòdul sòlid amb calcificació, una característica associada a la benignitat, mentre que el cas 2 es presentava com un nòdul parcialment sòlid indeterminat sense trets benignes evidents.Tres rondes de TC de seguiment van mostrar que aquests casos es van mantenir estables durant un període de 4 anys i, per tant, es van considerar nòduls benignes (Fig. 4a).En comparació amb l'avaluació clínica de les exploracions de TC en sèrie, l'anàlisi de metabòlits sèrics d'un sol tir amb el model de classificador actual va identificar ràpidament i correctament aquests nòduls benignes basant-se en limitacions probabilístiques (taula 1).La figura 4b en el cas 3 mostra un nòdul amb signes de retracció pleural, que s'associa més sovint amb malignitat32.El cas 4 es presenta com un nòdul parcialment sòlid indeterminat sense evidència d'una causa benigna.Tots aquests casos es van predir com a malignes segons el model de classificador (taula 1).La valoració de l'adenocarcinoma pulmonar es va demostrar mitjançant l'examen histopatològic després de la cirurgia de resecció pulmonar (Fig. 4b).Per al conjunt de validació externa, el classificador metabòlic va predir amb precisió dos casos de nòduls pulmonars indeterminats de més de 6 mm (figura suplementària 10).
Imatges de TAC de la finestra axial dels pulmons de dos casos de nòduls benignes.En el cas 1, la TAC després de 4 anys va mostrar un nòdul sòlid estable de 7 mm amb calcificació al lòbul inferior dret.En el cas 2, la TAC després de 5 anys va revelar un nòdul estable i parcialment sòlid amb un diàmetre de 7 mm al lòbul superior dret.b Imatges de TC amb finestra axial dels pulmons i estudis patològics corresponents de dos casos d'adenocarcinoma en estadi I abans de la resecció pulmonar.El cas 3 va revelar un nòdul amb un diàmetre de 8 mm al lòbul superior dret amb retracció pleural.El cas 4 va revelar un nòdul de vidre esmolat parcialment sòlid que mesurava 9 mm al lòbul superior esquerre.Tinció d'hematoxilina i eosina (H&E) del teixit pulmonar resecat (barra d'escala = 50 μm) que demostra el patró de creixement acinar de l'adenocarcinoma pulmonar.Les fletxes indiquen nòduls detectats a les imatges de TC.Les imatges H&E són imatges representatives de múltiples (>3) camps microscòpics examinats pel patòleg.
En conjunt, els nostres resultats demostren el valor potencial dels biomarcadors de metabòlits sèrics en el diagnòstic diferencial dels nòduls pulmonars, que poden suposar reptes a l'hora d'avaluar el cribratge de TC.
A partir d'un panell de metabòlits diferencials validat, hem intentat identificar els correlats biològics dels canvis metabòlics importants.L'anàlisi d'enriquiment de la via KEGG per MetaboAnalyst va identificar 6 vies comuns alterades significativament entre els dos grups donats (LA vs. HC i LA vs. BN, p ajustat ≤ 0,001, efecte > 0,01).Aquests canvis es van caracteritzar per alteracions en el metabolisme del piruvat, el metabolisme del triptòfan, el metabolisme de la niacina i la nicotinamida, la glucòlisi, el cicle del TCA i el metabolisme de les purines (Fig. 5a).A continuació, vam realitzar més metabolòmica dirigida per verificar canvis importants mitjançant la quantificació absoluta.Determinació de metabòlits comuns en vies alterades habitualment mitjançant espectrometria de masses triple quadrupol (QQQ) mitjançant estàndards de metabòlits autèntics.Les característiques demogràfiques de la mostra objectiu de l'estudi de metabolòmica s'inclouen a la taula complementària 4. D'acord amb els nostres resultats globals de metabolòmica, l'anàlisi quantitativa va confirmar que la hipoxantina i la xantina, el piruvat i el lactat van augmentar a LA en comparació amb BN i HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Tanmateix, no es van trobar diferències significatives en aquests metabòlits entre BN i HC.
Anàlisi d'enriquiment de la via KEGG de metabòlits significativament diferents al grup LA en comparació amb els grups BN i HC.Es va utilitzar un Globaltest de dues cues i els valors de p es van ajustar mitjançant el mètode Holm-Bonferroni (p ajustat ≤ 0,001 i mida de l'efecte > 0,01).b–d Gràfics de violí que mostren els nivells d'hipoxantina, xantina, lactat, piruvat i triptòfan en sèrum HC, BN i LA determinats per LC-MS/MS (n = 70 per grup).Les línies de punts blancs i negres indiquen la mediana i el quartil, respectivament.e Gràfic de violí que mostra l'expressió d'ARNm de Log2TPM (transcripcions per milió) normalitzada de SLC7A5 i QPRT en adenocarcinoma pulmonar (n = 513) en comparació amb el teixit pulmonar normal (n = 59) al conjunt de dades LUAD-TCGA.El quadre blanc representa l'interval interquartil, la línia negra horitzontal al centre representa la mediana i la línia negra vertical que s'estén des del quadre representa l'interval de confiança (IC) del 95%.f Gràfic de correlació de Pearson de l'expressió SLC7A5 i GAPDH en adenocarcinoma pulmonar (n = 513) i teixit pulmonar normal (n = 59) al conjunt de dades TCGA.L'àrea grisa representa l'IC del 95%.r, coeficient de correlació de Pearson.g Nivells de triptòfan cel·lular normalitzats en cèl·lules A549 transfectades amb control de shRNA inespecífic (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinats per LC-MS/MS.Es presenta l'anàlisi estadística de cinc mostres biològicament independents de cada grup.h Nivells cel·lulars de NADt (NAD total, inclosos NAD+ i NADH) a les cèl·lules A549 (NC) i a les cèl·lules A549 de derrota SLC7A5 (Sh1, Sh2).Es presenta l'anàlisi estadística de tres mostres biològicament independents de cada grup.i L'activitat glicolítica de les cèl·lules A549 abans i després de la derrota de SLC7A5 es va mesurar mitjançant la taxa d'acidificació extracel·lular (ECAR) (n = 4 mostres biològicament independents per grup).2-DG,2-desoxi-D-glucosa.La prova t de Student de dues cues es va utilitzar a (b–h).A (g–i), les barres d'error representen la mitjana ± SD, cada experiment es va realitzar tres vegades de manera independent i els resultats van ser similars.Les dades font es proporcionen en forma de fitxers de dades font.
Tenint en compte l'impacte significatiu del metabolisme alterat del triptòfan al grup LA, també vam avaluar els nivells de triptòfan sèric als grups HC, BN i LA mitjançant QQQ.Vam trobar que el triptòfan sèric es va reduir a LA en comparació amb HC o BN (p <0, 001, figura 5d), cosa que és coherent amb troballes anteriors que els nivells de triptòfan circulant són més baixos en pacients amb càncer de pulmó que en controls sans del grup control33,34. ,35.Un altre estudi que utilitzava el traçador PET/CT 11C-metil-L-triptòfan va trobar que el temps de retenció del senyal de triptòfan al teixit del càncer de pulmó va augmentar significativament en comparació amb les lesions benignes o el teixit normal36.Presentem la hipòtesi que la disminució del triptòfan al sèrum LA pot reflectir la captació activa de triptòfan per part de les cèl·lules canceroses de pulmó.
També se sap que el producte final de la via de la quinurenina del catabolisme del triptòfan és NAD+37,38, que és un substrat important per a la reacció del gliceraldehid-3-fosfat amb l'1,3-bisfosfoglicerat en la glucòlisi39.Si bé els estudis anteriors s'han centrat en el paper del catabolisme del triptòfan en la regulació immune, hem intentat dilucidar la interacció entre la desregulació del triptòfan i les vies glicolíticas observades en l'estudi actual.Se sap que el membre 5 de la família de transportadors de soluts 7 (SLC7A5) és un transportador de triptòfan43,44,45.La fosforibosiltransferasa de l'àcid quinolínic (QPRT) és un enzim situat aigües avall de la via de la quinurenina que converteix l'àcid quinolínic en NAMN46.La inspecció del conjunt de dades LUAD TCGA va revelar que tant SLC7A5 com QPRT estaven significativament regulats en el teixit tumoral en comparació amb el teixit normal (Fig. 5e).Aquest augment es va observar en les etapes I i II, així com en les etapes III i IV de l'adenocarcinoma pulmonar (figura suplementària 11), cosa que indica alteracions primerenques en el metabolisme del triptòfan associats a la tumorigènesi.
A més, el conjunt de dades LUAD-TCGA va mostrar una correlació positiva entre l'expressió d'ARNm de SLC7A5 i GAPDH en mostres de pacients amb càncer (r = 0, 45, p = 1, 55E-26, figura 5f).En canvi, no es va trobar cap correlació significativa entre aquestes signatures gèniques al teixit pulmonar normal (r = 0, 25, p = 0, 06, figura 5f).La derrota de SLC7A5 (figura suplementària 12) a les cèl·lules A549 va reduir significativament els nivells de triptòfan cel·lular i NAD (H) (figura 5g, h), donant lloc a una activitat glicolítica atenuada mesurada per la taxa d'acidificació extracel·lular (ECAR) (figura 1).5i).Així, basant-nos en els canvis metabòlics en sèrum i en la detecció in vitro, es planteja la hipòtesi que el metabolisme del triptòfan pot produir NAD + a través de la via de la quinurenina i tenir un paper important en la promoció de la glucòlisi en el càncer de pulmó.
Els estudis han demostrat que un gran nombre de nòduls pulmonars indeterminats detectats per LDCT poden comportar la necessitat de proves addicionals com ara PET-TC, biòpsia pulmonar i tractament excessiu a causa d'un diagnòstic fals positiu de malignitat.31 Com es mostra a la figura 6, el nostre estudi va identificar un panell de metabòlits sèrics amb un valor diagnòstic potencial que pot millorar l'estratificació del risc i la gestió posterior dels nòduls pulmonars detectats per TC.
Els nòduls pulmonars s'avaluen mitjançant tomografia computada a dosis baixes (LDCT) amb característiques d'imatge que suggereixen causes benignes o malignes.El resultat incert dels nòduls pot provocar visites de seguiment freqüents, intervencions innecessàries i un tractament excessiu.La inclusió de classificadors metabòlics sèrics amb valor diagnòstic pot millorar l'avaluació del risc i la gestió posterior dels nòduls pulmonars.Tomografia per emissió de positrons PET.
Les dades de l'estudi nord-americà NLST i l'estudi europeu NELSON suggereixen que el cribratge de grups d'alt risc amb tomografia computada de dosis baixes (LDCT) pot reduir la mortalitat per càncer de pulmó1,3.Tanmateix, l'avaluació del risc i la gestió clínica posterior d'un gran nombre de nòduls pulmonars incidentals detectats per LDCT segueixen sent els més difícils.L'objectiu principal és optimitzar la classificació correcta dels protocols basats en LDCT existents incorporant biomarcadors fiables.
S'han identificat certs biomarcadors moleculars, com els metabòlits sanguinis, comparant el càncer de pulmó amb controls sans15,17.En l'estudi actual, ens hem centrat en l'aplicació de l'anàlisi de la metabolòmica sèrica per distingir entre nòduls pulmonars benignes i malignes detectats incidentalment per LDCT.Hem comparat el metaboloma sèric global de control sa (HC), nòduls pulmonars benignes (BN) i mostres d'adenocarcinoma pulmonar (LA) en etapa I mitjançant l'anàlisi UPLC-HRMS.Vam trobar que HC i BN tenien perfils metabòlics similars, mentre que LA mostrava canvis significatius en comparació amb HC i BN.Hem identificat dos conjunts de metabòlits sèrics que diferencien LA de HC i BN.
L'esquema actual d'identificació basat en LDCT per a nòduls benignes i malignes es basa principalment en la mida, la densitat, la morfologia i la taxa de creixement dels nòduls al llarg del temps30.Estudis anteriors han demostrat que la mida dels nòduls està estretament relacionada amb la probabilitat de càncer de pulmó.Fins i tot en pacients d'alt risc, el risc de malignitat en els ganglis <6 mm és <1%.El risc de malignitat per als nòduls de 6 a 20 mm oscil·la entre el 8% i el 64%30.Per tant, la Fleischner Society recomana un diàmetre de tall de 6 mm per al seguiment rutinari de la TC.29 No obstant això, l'avaluació del risc i la gestió dels nòduls pulmonars indeterminats (NPI) de més de 6 mm no s'han realitzat adequadament 31 .El tractament actual de la cardiopatia congènita es basa generalment en l'espera atenta amb un seguiment freqüent de TC.
A partir del metaboloma validat, vam demostrar per primera vegada la superposició de signatures metabolòmiques entre individus sans i nòduls benignes <6 mm.La similitud biològica és coherent amb les troballes anteriors de la TC que el risc de malignitat per als nòduls <6 mm és tan baix com per als subjectes sense ganglis.30 Cal assenyalar que els nostres resultats també demostren que els nòduls benignes <6 mm i ≥6 mm tenen un alt nivell. semblança en els perfils metabolòmics, cosa que suggereix que la definició funcional de l'etiologia benigna és coherent independentment de la mida del nòdul.Així, els moderns panells de metabòlits sèrics de diagnòstic poden proporcionar un únic assaig com a prova de descartar quan es detecten inicialment nòduls a la TC i potencialment reduir el seguiment en sèrie.Al mateix temps, el mateix panell de biomarcadors metabòlics va distingir nòduls malignes ≥6 mm de mida dels nòduls benignes i va proporcionar prediccions precises per a IPN de mida similar i característiques morfològiques ambigües a les imatges de TC.Aquest classificador del metabolisme sèric va funcionar bé en predir la malignitat dels nòduls ≥6 mm amb un AUC de 0,927.En conjunt, els nostres resultats indiquen que les signatures metabolòmiques sèriques úniques poden reflectir específicament els canvis metabòlics primerencs induïts pel tumor i tenir un valor potencial com a predictors de risc, independentment de la mida del nòdul.
En particular, l'adenocarcinoma de pulmó (LUAD) i el carcinoma de cèl·lules escamoses (LUSC) són els principals tipus de càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC).Atès que el LUSC està fortament associat amb el consum de tabac47 i el LUAD és la histologia més comuna dels nòduls pulmonars incidentals detectats en el cribratge de TC48, el nostre model de classificador es va crear específicament per a mostres d'adenocarcinoma en fase I.Wang i els seus col·legues també es van centrar en LUAD i van identificar nou signatures de lípids mitjançant lipidòmica per distingir el càncer de pulmó en fase inicial dels individus sans17.Vam provar el model de classificador actual en 16 casos de LUSC en fase I i 74 nòduls benignes i vam observar una precisió de predicció de LUSC baixa (AUC 0,776), cosa que suggereix que LUAD i LUSC poden tenir les seves pròpies signatures metabolòmiques.De fet, s'ha demostrat que LUAD i LUSC difereixen en etiologia, origen biològic i aberracions genètiques49.Per tant, s'han d'incloure altres tipus d'histologia en els models de formació per a la detecció poblacional del càncer de pulmó en els programes de cribratge.
Aquí, vam identificar les sis vies alterades amb més freqüència en l'adenocarcinoma pulmonar en comparació amb controls sans i nòduls benignes.La xantina i la hipoxantina són metabòlits comuns de la via metabòlica de les purines.D'acord amb els nostres resultats, els intermedis associats al metabolisme de les purines es van incrementar significativament en el sèrum o els teixits de pacients amb adenocarcinoma pulmonar en comparació amb controls sans o pacients en fase preinvasiva15,50.Els nivells sèrics elevats de xantina i hipoxantina poden reflectir l'anabolisme requerit per les cèl·lules canceroses que proliferan ràpidament.La desregulació del metabolisme de la glucosa és un segell ben conegut del metabolisme del càncer51.Aquí, vam observar un augment significatiu de piruvat i lactat al grup LA en comparació amb el grup HC i BN, que és coherent amb els informes anteriors d'anomalies de la via glicolítica en els perfils del metaboloma sèric de pacients amb càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC) i controls saludables.els resultats són coherents52,53.
És important destacar que vam observar una correlació inversa entre el metabolisme del piruvat i el triptòfan en el sèrum dels adenocarcinomes pulmonars.Els nivells sèrics de triptòfan es van reduir al grup LA en comparació amb el grup HC o BN.Curiosament, un estudi anterior a gran escala que utilitzava una cohort prospectiva va trobar que els nivells baixos de triptòfan circulant estaven associats amb un augment del risc de càncer de pulmó 54 .El triptòfan és un aminoàcid essencial que obtenim totalment dels aliments.Arribem a la conclusió que l'esgotament del triptòfan sèric en l'adenocarcinoma pulmonar pot reflectir un esgotament ràpid d'aquest metabòlit.És ben sabut que el producte final del catabolisme del triptòfan a través de la via de la quinurenina és la font de la síntesi de nou NAD+.Com que el NAD+ es produeix principalment a través de la via de salvament, la importància del NAD+ en el metabolisme del triptòfan en salut i malaltia encara està per determinar46.La nostra anàlisi de la base de dades TCGA va mostrar que l'expressió del transportador de solut del transportador de triptòfan 7A5 (SLC7A5) va augmentar significativament en l'adenocarcinoma pulmonar en comparació amb els controls normals i es va correlacionar positivament amb l'expressió de l'enzim glicolític GAPDH.Estudis anteriors s'han centrat principalment en el paper del catabolisme del triptòfan en la supressió de la resposta immune antitumoral40,41,42.Aquí demostrem que la inhibició de la captació de triptòfan mitjançant la derrota de SLC7A5 a les cèl·lules canceroses de pulmó provoca una disminució posterior dels nivells de NAD cel·lular i una atenuació concomitant de l'activitat glicolítica.En resum, el nostre estudi proporciona una base biològica per als canvis en el metabolisme sèric associats a la transformació maligna de l'adenocarcinoma pulmonar.
Les mutacions EGFR són les mutacions conductores més comunes en pacients amb NSCLC.En el nostre estudi, vam trobar que els pacients amb mutació d'EGFR (n = 41) tenien perfils metabolòmics generals similars als pacients amb EGFR de tipus salvatge (n = 31), tot i que vam trobar una disminució dels nivells sèrics d'alguns pacients mutants d'EGFR en pacients amb acilcarnitina.La funció establerta de les acilcarnitines és transportar grups acil del citoplasma a la matriu mitocondrial, donant lloc a l'oxidació dels àcids grassos per produir energia 55 .D'acord amb les nostres troballes, un estudi recent també va identificar perfils de metabolomes similars entre tumors mutants d'EGFR i EGFR de tipus salvatge mitjançant l'anàlisi del metaboloma global de 102 mostres de teixit d'adenocarcinoma pulmonar50.Curiosament, també es va trobar contingut d'acilcarnitina al grup de mutants EGFR.Per tant, si els canvis en els nivells d'acilcarnitina reflecteixen canvis metabòlics induïts per EGFR i les vies moleculars subjacents poden merèixer més estudis.
En conclusió, el nostre estudi estableix un classificador metabòlic sèric per al diagnòstic diferencial dels nòduls pulmonars i proposa un flux de treball que pot optimitzar l'avaluació del risc i facilitar la gestió clínica a partir del cribratge de TAC.
Aquest estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ètica de l'Hospital de Càncer de la Universitat de Sun Yat-sen, el Primer Hospital Afiliat de la Universitat de Sun Yat-sen i el Comitè d'Ètica de l'Hospital de Càncer de la Universitat de Zhengzhou.En els grups de descobriment i validació interna, es van recollir 174 sèrums d'individus sans i 244 sèrums de nòduls benignes d'individus sotmesos a exàmens mèdics anuals al Departament de Control i Prevenció del Càncer, Sun Yat-sen University Cancer Center i 166 nòduls benignes.sèrum.Els adenocarcinomes pulmonars de l'etapa I es van recollir del Centre de càncer de la Universitat de Sun Yat-sen.A la cohort de validació externa, hi va haver 48 casos de nòduls benignes, 39 casos d'adenocarcinoma pulmonar en estadi I del Primer Hospital Afiliat de la Universitat Sun Yat-sen i 24 casos d'adenocarcinoma pulmonar en estadi I de l'Hospital de Càncer de Zhengzhou.El centre de càncer de la Universitat Sun Yat-sen també va recollir 16 casos de càncer de pulmó de cèl·lules escamoses en estadi I per provar la capacitat diagnòstica del classificador metabòlic establert (les característiques del pacient es mostren a la taula suplementària 5).Es van recollir mostres de la cohort de descobriment i la cohort de validació interna entre gener de 2018 i maig de 2020. Es van recollir mostres de la cohort de validació externa entre agost de 2021 i octubre de 2022. Per minimitzar el biaix de gènere, es van assignar un nombre aproximadament igual de casos masculins i femenins a cadascun. cohort.Equip de descoberta i equip de revisió interna.El gènere dels participants es va determinar a partir de l'autoinforme.Es va obtenir el consentiment informat de tots els participants i no es va oferir cap compensació.Els subjectes amb nòduls benignes eren aquells amb una puntuació de TAC estable entre 2 i 5 anys en el moment de l'anàlisi, excepte 1 cas de la mostra de validació externa, que es va recollir preoperatòriament i es va diagnosticar per histopatologia.Amb l'excepció de la bronquitis crònica.Els casos d'adenocarcinoma pulmonar es van recollir abans de la resecció pulmonar i es van confirmar mitjançant un diagnòstic patològic.Es van recollir mostres de sang en dejuni en tubs de separació de sèrum sense cap anticoagulant.Les mostres de sang es van coagular durant 1 hora a temperatura ambient i després es van centrifugar a 2851 × g durant 10 minuts a 4 ° C per recollir el sobrenedant sèric.Les alíquotes de sèrum es van congelar a -80 ° C fins a l'extracció del metabòlit.El Departament de Prevenció del Càncer i Examen Mèdic del Centre de Càncer de la Universitat de Sun Yat-sen va recollir un grup de sèrum de 100 donants sans, incloent un nombre igual d'homes i dones d'entre 40 i 55 anys.Es van barrejar volums iguals de cada mostra donant, el conjunt resultant es va dividir en alíquotes i es va emmagatzemar a -80 ° C.La barreja de sèrum es va utilitzar com a material de referència per al control de qualitat i l'estandardització de dades.
El sèrum de referència i les mostres de prova es van descongelar i els metabòlits es van extreure mitjançant un mètode d'extracció combinat (MTBE/metanol/aigua) 56 .Breument, es van barrejar 50 μl de sèrum amb 225 μl de metanol fred amb gel i 750 μl de metil tert-butil èter (MTBE).Remeneu la barreja i s'incube en gel durant 1 hora.A continuació, es van barrejar les mostres i es van barrejar amb vòrtex amb 188 μl d'aigua de grau MS que contenia estàndards interns (lactat 13C, piruvat 13C3, metionina 13C i isoleucina 13C6, adquirits a Cambridge Isotope Laboratories).A continuació, la barreja es va centrifugar a 15.000 × g durant 10 min a 4 ° C i la fase inferior es va transferir a dos tubs (125 μL cadascun) per a l'anàlisi LC-MS en modes positius i negatius.Finalment, la mostra es va evaporar fins a sequedat en un concentrador de buit d'alta velocitat.
Els metabòlits secs es van reconstituir en 120 μl d'acetonitril al 80%, es van vortexar durant 5 min i es van centrifugar a 15.000 × g durant 10 min a 4 ° C.Els sobrenedants es van transferir a vials de vidre ambre amb microinserts per a estudis de metabolòmica.Anàlisi metabolòmica no dirigida en una plataforma d'espectrometria de masses d'alta resolució (UPLC-HRMS) de cromatografia líquida d'ultra rendiment.Els metabòlits es van separar mitjançant un sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC i una columna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters).En mode d'ions positius, les fases mòbils eren del 95% (A) i del 50% d'acetonitril (B), cadascuna contenint 10 mmol/L d'acetat d'amoni i un 0,1% d'àcid fòrmic.En mode negatiu, les fases mòbils A i B contenien un 95% i un 50% d'acetonitril, respectivament, ambdues fases contenien 10 mmol/L d'acetat d'amoni, pH = 9. El programa de gradient va ser el següent: 0–0,5 min, 2% B;0,5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16,1–20 min, 2% B. La columna es va mantenir a 40 °C i la mostra a 10 °C a l'automostredor.El cabal era de 0,3 ml/min, el volum d'injecció era de 3 μl.Es va fer funcionar un espectròmetre de masses Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) amb una font d'ionització per electrospray (ESI) en mode d'escaneig complet i es va combinar amb el mode de monitorització ddMS2 per recollir grans volums de dades.Els paràmetres MS es van establir de la següent manera: tensió de polvorització +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura capil·lar 320 °C, gas de protecció 40 arb, gas auxiliar 10 arb, temperatura de l'escalfador de la sonda 350 °C, rang d'exploració 70–1050 m/h, resolució.70 000. Les dades es van adquirir mitjançant Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Per avaluar la qualitat de les dades, es van generar mostres de control de qualitat agrupades (QC) eliminant alíquotes de 10 μL del sobrenedant de cada mostra.Es van analitzar sis injeccions de mostres de control de qualitat a l'inici de la seqüència analítica per avaluar l'estabilitat del sistema UPLC-MS.Les mostres de control de qualitat s'introdueixen periòdicament al lot.Els 11 lots de mostres de sèrum d'aquest estudi es van analitzar mitjançant LC-MS.Es van utilitzar alíquotes d'una barreja de sèrum de 100 donants sans com a material de referència en lots respectius per controlar el procés d'extracció i ajustar els efectes de lot a lot.L'anàlisi metabolòmica no dirigida de la cohort de descobriment, la cohort de validació interna i la cohort de validació externa es va realitzar al Centre de Metabolòmica de la Universitat Sun Yat-sen.El laboratori extern del Centre d'anàlisi i proves de la Universitat de Tecnologia de Guangdong també va analitzar 40 mostres de la cohort externa per provar el rendiment del model de classificador.
Després de l'extracció i la reconstitució, es va mesurar la quantificació absoluta dels metabòlits sèrics mitjançant cromatografia líquida d'ultraalt rendiment-espectrometria de masses en tàndem (Agilent 6495 triple quadrupol) amb una font d'ionització electrospray (ESI) en mode de monitorització de reaccions múltiples (MRM).Es va utilitzar una columna ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) per separar metabòlits.La fase mòbil constava d'un 90% (A) i un 5% d'acetonitril (B) amb 10 mmol/L d'acetat d'amoni i una solució d'amoníac al 0,1%.El programa de gradients va ser el següent: 0–1,5 min, 0% B;1,5–6,5 min, 0–15% B;6,5–8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5–11,5 min, 0% B.La columna es va mantenir a 40 °C i la mostra a 10 °C a l'automostredor.El cabal era de 0, 3 ml/min i el volum d'injecció era d'1 μL.Els paràmetres MS es van establir de la següent manera: tensió capil·lar ± 3,5 kV, pressió del nebulitzador 35 psi, flux de gas de la funda 12 L/min, temperatura del gas de la funda 350 ° C, temperatura del gas d'assecat 250 ° C i flux de gas d'assecat 14 l / min.Les conversions MRM de triptòfan, piruvat, lactat, hipoxantina i xantina van ser de 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 i 151,0–107.9 respectivament.Les dades es van recollir mitjançant Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Per a mostres de sèrum, es van quantificar triptòfan, piruvat, lactat, hipoxantina i xantina mitjançant corbes de calibratge de solucions de mescles estàndard.Per a les mostres cel·lulars, el contingut de triptòfan es va normalitzar a l'estàndard intern i la massa de proteïnes cel·lulars.
L'extracció de pics (m/z i temps de retenció (RT)) es va realitzar mitjançant Compound Discovery 3.1 i TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Per eliminar les diferències potencials entre lots, cada pic característic de la mostra de prova es va dividir pel pic característic del material de referència del mateix lot per obtenir l'abundància relativa.Les desviacions estàndard relatives dels estàndards interns abans i després de l'estandardització es mostren a la taula complementària 6. Les diferències entre els dos grups es van caracteritzar per una taxa de descobriment fals (FDR <0, 05, prova de rang signat de Wilcoxon) i canvi de plec (> 1, 2 o < 0, 83).Les dades de MS en brut de les característiques extretes i les dades de MS de referència corregides per sèrum es mostren a les dades suplementàries 1 i les dades suplementàries 2, respectivament.L'anotació màxima es va realitzar a partir de quatre nivells definits d'identificació, inclosos metabòlits identificats, compostos putativament anotats, classes de compostos suposadament caracteritzats i compostos desconeguts 22 .A partir de les cerques de bases de dades a Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), finalment es van seleccionar compostos biològics amb estàndards validats coincidents amb MS/MS o anotacions de concordança exacta a mzCloud (puntuació > 85) o Chemspider com a intermediaris entre el metaboloma diferencial.Les anotacions màximes per a cada característica s'inclouen a les dades suplementàries 3. Es va utilitzar MetaboAnalyst 5.0 per a l'anàlisi univariada de l'abundància de metabòlits normalitzats en suma.MetaboAnalyst 5.0 també va avaluar l'anàlisi d'enriquiment de la via KEGG basada en metabòlits significativament diferents.L'anàlisi de components principals (PCA) i l'anàlisi discriminant de mínims quadrats parcials (PLS-DA) es van analitzar mitjançant el paquet de programari ropls (v.1.26.4) amb normalització de pila i autoescala.El model de biomarcador de metabòlits òptim per predir la malignitat dels nòduls es va generar mitjançant una regressió logística binària amb un operador de selecció i contracció mínima absoluta (LASSO, paquet R v.4.1-3).El rendiment del model discriminant en els conjunts de detecció i validació es va caracteritzar estimant l'AUC a partir de l'anàlisi ROC segons el paquet pROC (v.1.18.0.).El tall de probabilitat òptim es va obtenir a partir de l'índex de Youden màxim del model (sensibilitat + especificitat - 1).Les mostres amb valors inferiors o superiors al llindar es preveuen com a nòduls benignes i adenocarcinoma pulmonar, respectivament.
Les cèl·lules A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) es van cultivar en medi F-12K que contenia un 10% de FBS.Es van inserir seqüències curtes d'ARN (shRNA) dirigides a SLC7A5 i un control no orientat (NC) al vector lentiviral pLKO.1-puro.Les seqüències antisentit de shSLC7A5 són les següents: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Els anticossos contra SLC7A5 (#5347) i tubulina (#2148) es van comprar a Cell Signaling Technology.Es van utilitzar anticossos contra SLC7A5 i tubulina a una dilució d'1:1000 per a l'anàlisi de Western blot.
El Seahorse XF Glycolytic Stress Test mesura els nivells d'acidificació extracel·lular (ECAR).En l'assaig, es van administrar glucosa, oligomicina A i 2-DG seqüencialment per provar la capacitat glicolítica cel·lular mesurada per ECAR.
Les cèl·lules A549 transfectades amb control no orientat (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) es van xapar durant la nit en plats de 10 cm de diàmetre.Els metabòlits cel·lulars es van extreure amb 1 ml de metanol aquós al 80% fred amb gel.Les cèl·lules de la solució de metanol es van eliminar, es van recollir en un tub nou i es van centrifugar a 15.000 × g durant 15 min a 4 ° C.Recollir 800 µl de sobrenedant i assecar amb un concentrador de buit d'alta velocitat.A continuació, es van analitzar els pellets de metabòlits secs per determinar els nivells de triptòfan mitjançant LC-MS/MS tal com es descriu anteriorment.Els nivells cel·lulars de NAD(H) a les cèl·lules A549 (NC i shSLC7A5) es van mesurar mitjançant un kit colorimètric quantitatiu de NAD +/NADH (#K337, BioVision) segons les instruccions del fabricant.Es van mesurar els nivells de proteïnes per a cada mostra per normalitzar la quantitat de metabòlits.
No es van utilitzar mètodes estadístics per determinar preliminarment la mida de la mostra.Els estudis de metabolòmica anteriors dirigits al descobriment de biomarcadors15,18 s'han considerat com a punts de referència per a la determinació de la mida i, en comparació amb aquests informes, la nostra mostra era adequada.No es va excloure cap mostra de la cohort d'estudi.Les mostres de sèrum es van assignar aleatòriament a un grup de descobriment (306 casos, 74,6%) i a un grup de validació interna (104 casos, 25,4%) per a estudis de metabolòmica no dirigits.També vam seleccionar aleatòriament 70 casos de cada grup del conjunt de descobriments per a estudis de metabolòmica dirigits.Els investigadors van quedar cecs a l'assignació de grups durant la recollida i l'anàlisi de dades LC-MS.Les anàlisis estadístiques de dades de metabolòmica i experiments amb cèl·lules es descriuen a les respectives seccions de resultats, llegendes de figures i mètodes.La quantificació del triptòfan cel·lular, el NADT i l'activitat glicolítica es va realitzar tres vegades de manera independent amb resultats idèntics.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de l'informe Natural Portfolio associat a aquest article.
Les dades de MS en brut de les característiques extretes i les dades de MS normalitzades del sèrum de referència es mostren a les dades suplementàries 1 i les dades suplementàries 2, respectivament.Les anotacions màximes de les característiques diferencials es presenten a les dades suplementàries 3. El conjunt de dades LUAD TCGA es pot descarregar des de https://portal.gdc.cancer.gov/.Les dades d'entrada per traçar el gràfic es proporcionen a les dades font.Les dades font d'aquest article es proporcionen.
National Lung Screening Study Group, etc. Reducció de la mortalitat per càncer de pulmó amb tomografia computada a dosis baixes.Nord d'Anglaterra.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR i Prophet, PC Cribratge del càncer de pulmó mitjançant TC helicoïdal de dosis baixes: resultats del National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Pantalla 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Reducció de la mortalitat per càncer de pulmó amb cribratge de TC volumètric en un assaig aleatoritzat.Nord d'Anglaterra.J. Med.382, 503–513 (2020).
Hora de publicació: 18-set-2023