El diagnòstic diferencial dels nòduls pulmonars identificats per tomografia computada (TC) continua sent un repte en la pràctica clínica. Aquí, caracteritzem el metaboloma global de 480 mostres de sèrum, incloent-hi controls sans, nòduls pulmonars benignes i adenocarcinoma pulmonar en estadi I. Els adenocarcinomes presenten perfils metabolòmics únics, mentre que els nòduls benignes i els individus sans tenen una alta similitud en els perfils metabolòmics. En el grup de descobriment (n = 306), es va identificar un conjunt de 27 metabòlits per diferenciar entre nòduls benignes i malignes. L'AUC del model discriminant en els grups de validació interna (n = 104) i validació externa (n = 111) va ser de 0,915 i 0,945, respectivament. L'anàlisi de les vies metabòliques va revelar un augment dels metabòlits glucolítics associats amb una disminució del triptòfan en el sèrum d'adenocarcinoma pulmonar en comparació amb els nòduls benignes i els controls sans, i va suggerir que la captació de triptòfan promou la glucòlisi en les cèl·lules de càncer de pulmó. El nostre estudi destaca el valor dels biomarcadors de metabòlits sèrics en l'avaluació del risc de nòduls pulmonars detectats per TC.
El diagnòstic precoç és fonamental per millorar les taxes de supervivència dels pacients amb càncer. Els resultats de l'Assaig Nacional de Detecció del Càncer de Pulmó dels EUA (NLST) i l'Estudi Europeu NELSON han demostrat que el cribratge amb tomografia computada de dosi baixa (LDCT) pot reduir significativament la mortalitat per càncer de pulmó en grups d'alt risc1,2,3. Des de l'ús generalitzat de la LDCT per al cribratge del càncer de pulmó, la incidència de troballes radiogràfiques incidentals de nòduls pulmonars asimptomàtics ha continuat augmentant4. Els nòduls pulmonars es defineixen com a opacitats focals de fins a 3 cm de diàmetre5. Tenim dificultats per avaluar la probabilitat de malignitat i tractar el gran nombre de nòduls pulmonars detectats incidentalment a la LDCT. Les limitacions de la TC poden conduir a exàmens de seguiment freqüents i resultats falsos positius, cosa que comporta una intervenció innecessària i un tractament excessiu6. Per tant, cal desenvolupar biomarcadors fiables i útils per identificar correctament el càncer de pulmó en les primeres etapes i diferenciar la majoria dels nòduls benignes en la detecció inicial7.
L'anàlisi molecular exhaustiva de la sang (sèrum, plasma, cèl·lules mononuclears de sang perifèrica), incloent-hi la genòmica, la proteòmica o la metilació de l'ADN8,9,10, ha portat a un interès creixent en el descobriment de biomarcadors diagnòstics per al càncer de pulmó. Mentrestant, els enfocaments metabolòmics mesuren els productes finals cel·lulars que estan influenciats per accions endògenes i exògenes i, per tant, s'apliquen per predir l'aparició i el resultat de la malaltia. La cromatografia líquida-espectrometria de masses en tàndem (LC-MS) és un mètode àmpliament utilitzat per a estudis metabolòmics a causa de la seva alta sensibilitat i el seu ampli rang dinàmic, que pot abastar metabòlits amb diferents propietats fisicoquímiques11,12,13. Tot i que l'anàlisi metabolòmica global del plasma/sèrum s'ha utilitzat per identificar biomarcadors associats amb el diagnòstic de càncer de pulmó14,15,16,17 i l'eficàcia del tractament,18 els classificadors de metabòlits sèrics per distingir entre nòduls pulmonars benignes i malignes encara s'han d'estudiar molt. -recerca massiva.
L'adenocarcinoma i el carcinoma de cèl·lules escamoses són els dos subtipus principals de càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC). Diverses proves de cribratge per TC indiquen que l'adenocarcinoma és el tipus histològic més comú de càncer de pulmó1,19,20,21. En aquest estudi, vam utilitzar cromatografia líquida d'ultra rendiment-espectrometria de masses d'alta resolució (UPLC-HRMS) per realitzar anàlisis metabolòmiques en un total de 695 mostres de sèrum, incloent-hi controls sans, nòduls pulmonars benignes i ≤3 cm detectats per TC. Cribratge de l'adenocarcinoma pulmonar en estadi I. Vam identificar un panell de metabòlits sèrics que distingeixen l'adenocarcinoma pulmonar dels nòduls benignes i els controls sans. L'anàlisi d'enriquiment de vies metabòliques va revelar que el metabolisme anormal del triptòfan i la glucosa són alteracions comunes en l'adenocarcinoma pulmonar en comparació amb els nòduls benignes i els controls sans. Finalment, hem establert i validat un classificador metabòlic sèric amb alta especificitat i sensibilitat per distingir entre nòduls pulmonars malignes i benignes detectats per LDCT, cosa que pot ajudar en el diagnòstic diferencial precoç i l'avaluació del risc.
En l'estudi actual, es van recollir retrospectivament mostres de sèrum coincidents per sexe i edat de 174 controls sans, 292 pacients amb nòduls pulmonars benignes i 229 pacients amb adenocarcinoma pulmonar en estadi I. Les característiques demogràfiques dels 695 subjectes es mostren a la Taula Suplementària 1.
Com es mostra a la figura 1a, es van recollir un total de 480 mostres de sèrum, incloent-hi 174 mostres de control saludable (HC), 170 nòduls benignes (BN) i 136 mostres d'adenocarcinoma de pulmó (LA) en estadi I, al Centre Oncològic de la Universitat Sun Yat-sen. Cohort de descobriment per a la perfilació metabolòmica no dirigida mitjançant cromatografia líquida d'ultra rendiment-espectrometria de masses d'alta resolució (UPLC-HRMS). Com es mostra a la figura suplementària 1, es van identificar metabòlits diferencials entre LA i HC, LA i BN per establir un model de classificació i explorar més a fons l'anàlisi de vies diferencials. 104 mostres recollides pel Centre Oncològic de la Universitat Sun Yat-sen i 111 mostres recollides per dos altres hospitals van ser sotmeses a validació interna i externa, respectivament.
a Població d'estudi de la cohort de descobriment que es va sotmetre a una anàlisi metabolòmica sèrica global mitjançant cromatografia líquida d'ultrarendiment-espectrometria de masses d'alta resolució (UPLC-HRMS). b Anàlisi discriminant per mínims quadrats parcials (PLS-DA) del metaboloma total de 480 mostres de sèrum de la cohort d'estudi, incloent-hi controls sans (HC, n = 174), nòduls benignes (BN, n = 170) i adenocarcinoma pulmonar en estadi I (Los Angeles, n = 136). +ESI, mode d'ionització positiva per electroaspersió, -ESI, mode d'ionització negativa per electroaspersió. c–e Els metabòlits amb abundàncies significativament diferents en dos grups donats (prova de rang amb signe de Wilcoxon de dues cues, valor p ajustat a la taxa de descobriment fals, FDR <0,05) es mostren en vermell (canvi de plec > 1,2) i blau (canvi de plec < 0,83). ) que es mostren al gràfic del volcà. f Mapa de calor de clúster jeràrquic que mostra diferències significatives en el nombre de metabòlits anotats entre LA i BN. Les dades font es proporcionen en forma de fitxers de dades font.
El metaboloma sèric total de 174 HC, 170 BN i 136 LA en el grup de descobriment es va analitzar mitjançant l'anàlisi UPLC-HRMS. Primer mostrem que les mostres de control de qualitat (QC) s'agrupen estretament al centre d'un model d'anàlisi de components principals (PCA) no supervisat, confirmant l'estabilitat del rendiment de l'estudi actual (Figura suplementària 2).
Com es mostra a l'anàlisi discriminant per mínims quadrats parcials (PLS-DA) de la Figura 1b, vam trobar que hi havia diferències clares entre LA i BN, LA i HC en els modes d'ionització per electroaspersió positius (+ESI) i negatius (−ESI). Tanmateix, no es van trobar diferències significatives entre BN i HC en condicions +ESI i -ESI.
Vam trobar 382 característiques diferencials entre LA i HC, 231 característiques diferencials entre LA i BN, i 95 característiques diferencials entre BN i HC (prova de rangs amb signe de Wilcoxon, FDR <0,05 i canvi múltiple >1,2 o <0,83) (Figura .1c-e). Els pics es van anotar més a fons (Dades suplementàries 3) contra una base de dades (biblioteca mzCloud/HMDB/Chemspider) mitjançant el valor m/z, el temps de retenció i la cerca de l'espectre de masses de fragmentació (detalls descrits a la secció Mètodes) 22. Finalment, es van identificar 33 i 38 metabòlits anotats amb diferències significatives en abundància per a LA versus BN (Figura 1f i Taula suplementària 2) i LA versus HC (Figura suplementària 3 i Taula suplementària 2), respectivament. En canvi, només es van identificar 3 metabòlits amb diferències significatives en abundància en BN i HC (Taula suplementària 2), d'acord amb la superposició entre BN i HC en PLS-DA. Aquests metabòlits diferencials cobreixen una àmplia gamma de productes bioquímics (Figura suplementària 4). En conjunt, aquests resultats demostren canvis significatius en el metaboloma sèric que reflecteixen la transformació maligna del càncer de pulmó en estadi inicial en comparació amb els nòduls pulmonars benignes o els subjectes sans. Mentrestant, la similitud del metaboloma sèric de BN i HC suggereix que els nòduls pulmonars benignes poden compartir moltes característiques biològiques amb individus sans. Atès que les mutacions del gen del receptor del factor de creixement epidèrmic (EGFR) són freqüents en el subtipus 23 d'adenocarcinoma pulmonar, vam intentar determinar l'impacte de les mutacions impulsores en el metaboloma sèric. A continuació, vam analitzar el perfil metabolòmic general de 72 casos amb estat EGFR en el grup d'adenocarcinoma pulmonar. Curiosament, vam trobar perfils comparables entre pacients amb mutació EGFR (n = 41) i pacients de tipus salvatge EGFR (n = 31) en l'anàlisi PCA (Figura suplementària 5a). No obstant això, vam identificar 7 metabòlits l'abundància dels quals es va alterar significativament en pacients amb mutació EGFR en comparació amb pacients amb EGFR de tipus salvatge (prova t, p < 0,05 i canvi de plec > 1,2 o < 0,83) (Figura suplementària 5b). La majoria d'aquests metabòlits (5 de 7) són acilcarnitines, que tenen un paper important en les vies d'oxidació dels àcids grassos.
Com s'il·lustra en el flux de treball que es mostra a la Figura 2a, els biomarcadors per a la classificació de nòduls es van obtenir utilitzant operadors de mínima contracció absoluta i selecció basada en 33 metabòlits diferencials identificats a LA (n = 136) i BN (n = 170). Millor combinació de variables (LASSO): model de regressió logística binària. Es va utilitzar una validació creuada de deu vegades per provar la fiabilitat del model. La selecció de variables i la regularització dels paràmetres s'ajusten mitjançant una penalització de maximització de probabilitat amb el paràmetre λ24. L'anàlisi metabolòmica global es va realitzar de manera independent en els grups de validació interna (n = 104) i validació externa (n = 111) per provar el rendiment de classificació del model discriminant. Com a resultat, es van identificar 27 metabòlits del conjunt de descobriment com el millor model discriminant amb el valor mitjà d'AUC més gran (Fig. 2b), entre els quals 9 tenien una activitat augmentada i 18 una activitat disminuïda a LA en comparació amb BN (Fig. 2c).
Flux de treball per a la construcció d'un classificador de nòduls pulmonars, incloent-hi la selecció del millor panell de metabòlits sèrics del conjunt de descobriment mitjançant un model de regressió logística binària mitjançant validació creuada de deu vegades i l'avaluació del rendiment predictiu en conjunts de validació interns i externs. b Estadístiques de validació creuada del model de regressió LASSO per a la selecció de biomarcadors metabòlics. Els números donats anteriorment representen el nombre mitjà de biomarcadors seleccionats a una λ determinada. La línia puntejada vermella representa el valor mitjà de l'AUC a la lambda corresponent. Les barres d'error grises representen els valors mínims i màxims de l'AUC. La línia puntejada indica el millor model amb els 27 biomarcadors seleccionats. AUC, àrea sota la corba característica operativa del receptor (ROC). c Canvis de plecs de 27 metabòlits seleccionats al grup LA en comparació amb el grup BN al grup de descobriment. Columna vermella: activació. La columna blava és un descens. d–f Corbes de la característica operativa del receptor (ROC) que mostren la potència del model discriminant basat en 27 combinacions de metabòlits als conjunts de descobriment, validació interna i externa. Les dades font es proporcionen en forma de fitxers de dades font.
Es va crear un model de predicció basat en els coeficients de regressió ponderats d'aquests 27 metabòlits (Taula suplementària 3). L'anàlisi ROC basada en aquests 27 metabòlits va donar un valor d'àrea sota la corba (AUC) de 0,933, la sensibilitat del grup de descobriment va ser de 0,868 i l'especificitat de 0,859 (Fig. 2d). Mentrestant, entre els 38 metabòlits diferencials anotats entre LA i HC, un conjunt de 16 metabòlits va aconseguir una AUC de 0,902 amb una sensibilitat de 0,801 i una especificitat de 0,856 en la discriminació de LA de HC (Figura suplementària 6a-c). També es van comparar els valors d'AUC basats en diferents llindars de canvi de plec per a metabòlits diferencials. Vam trobar que el model de classificació va funcionar millor en la discriminació entre LA i BN (HC) quan el nivell de canvi de plec es va establir a 1,2 enfront d'1,5 o 2,0 (Figura suplementària 7a,b). El model de classificació, basat en 27 grups de metabòlits, es va validar encara més en cohorts internes i externes. L'AUC va ser de 0,915 (sensibilitat 0,867, especificitat 0,811) per a la validació interna i de 0,945 (sensibilitat 0,810, especificitat 0,979) per a la validació externa (Fig. 2e, f). Per avaluar l'eficiència interlaboratori, es van analitzar 40 mostres de la cohort externa en un laboratori extern tal com es descriu a la secció Mètodes. La precisió de la classificació va aconseguir una AUC de 0,925 (Figura suplementària 8). Com que el carcinoma de cèl·lules escamoses de pulmó (LUSC) és el segon subtipus més comú de càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC) després de l'adenocarcinoma de pulmó (LUAD), també vam provar la utilitat potencial validada dels perfils metabòlics. BN i 16 casos de LUSC. L'AUC de discriminació entre LUSC i BN va ser de 0,776 (Figura suplementària 9), cosa que indica una capacitat més deficient en comparació amb la discriminació entre LUAD i BN.
Els estudis han demostrat que la mida dels nòduls a les imatges de TC està positivament correlacionada amb la probabilitat de malignitat i continua sent un determinant important del tractament dels nòduls25,26,27. L'anàlisi de les dades de la gran cohort de l'estudi de cribratge NELSON va mostrar que el risc de malignitat en subjectes amb ganglis <5 mm era fins i tot similar al dels subjectes sense ganglis28. Per tant, la mida mínima que requereix un seguiment regular mitjançant TC és de 5 mm, tal com recomana la British Thoracic Society (BTS), i de 6 mm, tal com recomana la Fleischner Society29. Tanmateix, els nòduls de més de 6 mm i sense característiques benignes òbvies, anomenats nòduls pulmonars indeterminats (NPI), continuen sent un repte important en l'avaluació i la gestió a la pràctica clínica30,31. A continuació, vam examinar si la mida dels nòduls influïa en les signatures metabolòmiques utilitzant mostres agrupades de les cohorts de descobriment i validació interna. Centrant-nos en 27 biomarcadors validats, primer vam comparar els perfils de PCA dels metabolomes HC i BN sub-6 mm. Vam trobar que la majoria dels punts de dades per a HC i BN se superposaven, demostrant que els nivells de metabòlits sèrics eren similars en ambdós grups (Fig. 3a). Els mapes de característiques en diferents rangs de mida es van mantenir conservats en BN i LA (Fig. 3b, c), mentre que es va observar una separació entre nòduls malignes i benignes en el rang de 6-20 mm (Fig. 3d). Aquesta cohort tenia una AUC de 0,927, una especificitat de 0,868 i una sensibilitat de 0,820 per predir la malignitat dels nòduls que mesuraven de 6 a 20 mm (Fig. 3e, f). Els nostres resultats mostren que el classificador pot capturar els canvis metabòlics causats per la transformació maligna primerenca, independentment de la mida del nòdul.
ad Comparació dels perfils de PCA entre grups especificats basats en un classificador metabòlic de 27 metabòlits. CC i BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. en LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm i LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Corba de la característica operativa del receptor (ROC) que mostra el rendiment del model discriminant per a nòduls de 6–20 mm. f Els valors de probabilitat es van calcular a partir del model de regressió logística per a nòduls que mesuren de 6–20 mm. La línia grisa de punts representa el valor de tall òptim (0,455). Els números anteriors representen el percentatge de casos projectats per a Los Angeles. Utilitzeu una prova t de Student bilateral. PCA, anàlisi de components principals. Àrea sota la corba AUC. Les dades font es proporcionen en forma de fitxers de dades font.
Es van seleccionar quatre mostres (d'entre 44 i 61 anys) amb mides de nòduls pulmonars similars (7-9 mm) per il·lustrar el rendiment del model de predicció de malignitat proposat (Fig. 4a, b). En el cribratge inicial, el Cas 1 es va presentar com un nòdul sòlid amb calcificació, una característica associada amb la benignitat, mentre que el Cas 2 es va presentar com un nòdul parcialment sòlid indeterminat sense característiques benignes òbvies. Tres rondes de tomografies computaritzades de seguiment van mostrar que aquests casos es van mantenir estables durant un període de 4 anys i, per tant, es van considerar nòduls benignes (Fig. 4a). En comparació amb l'avaluació clínica de les tomografies computaritzades en sèrie, l'anàlisi de metabòlits sèrics d'una sola dosi amb el model classificador actual va identificar ràpidament i correctament aquests nòduls benignes basant-se en restriccions probabilístiques (Taula 1). La figura 4b del cas 3 mostra un nòdul amb signes de retracció pleural, que sovint s'associa amb malignitat32. El Cas 4 es va presentar com un nòdul parcialment sòlid indeterminat sense evidència de causa benigna. Tots aquests casos es van predir com a malignes segons el model classificador (Taula 1). L'avaluació de l'adenocarcinoma pulmonar es va demostrar mitjançant un examen histopatològic després de la cirurgia de resecció pulmonar (Fig. 4b). Per al conjunt de validació externa, el classificador metabòlic va predir amb precisió dos casos de nòduls pulmonars indeterminats de més de 6 mm (Figura suplementària 10).
Imatges de TC de la finestra axial dels pulmons de dos casos de nòduls benignes. En el cas 1, la TC després de 4 anys va mostrar un nòdul sòlid estable de 7 mm amb calcificació al lòbul inferior dret. En el cas 2, la TC després de 5 anys va revelar un nòdul estable, parcialment sòlid, amb un diàmetre de 7 mm al lòbul superior dret. b Imatges de TC de la finestra axial dels pulmons i estudis patològics corresponents de dos casos d'adenocarcinoma en estadi I abans de la resecció pulmonar. El cas 3 va revelar un nòdul amb un diàmetre de 8 mm al lòbul superior dret amb retracció pleural. El cas 4 va revelar un nòdul de vidre esmerilat parcialment sòlid de 9 mm al lòbul superior esquerre. Tinjió amb hematoxilina i eosina (H&E) del teixit pulmonar resectat (barra d'escala = 50 μm) que demostra el patró de creixement acinar de l'adenocarcinoma pulmonar. Les fletxes indiquen els nòduls detectats a les imatges de TC. Les imatges de H&E són imatges representatives de múltiples (>3) camps microscòpics examinats pel patòleg.
En conjunt, els nostres resultats demostren el valor potencial dels biomarcadors de metabòlits sèrics en el diagnòstic diferencial dels nòduls pulmonars, cosa que pot plantejar reptes a l'hora d'avaluar el cribratge per TC.
Basant-nos en un panell de metabòlits diferencials validat, vam intentar identificar correlats biològics dels principals canvis metabòlics. L'anàlisi d'enriquiment de vies KEGG mitjançant MetaboAnalyst va identificar 6 vies comunes significativament alterades entre els dos grups donats (LA vs. HC i LA vs. BN, p ajustada ≤ 0,001, efecte > 0,01). Aquests canvis es van caracteritzar per alteracions en el metabolisme del piruvat, el metabolisme del triptòfan, el metabolisme de la niacina i la nicotinamida, la glucòlisi, el cicle TCA i el metabolisme de les purines (Fig. 5a). A continuació, vam realitzar metabolòmiques dirigides per verificar els canvis principals mitjançant la quantificació absoluta. Determinació de metabòlits comuns en vies comunament alterades mitjançant espectrometria de masses de triple quadrupol (QQQ) utilitzant estàndards de metabòlits autèntics. Les característiques demogràfiques de la mostra objectiu de l'estudi metabolòmic s'inclouen a la Taula Suplementària 4. D'acord amb els nostres resultats metabolòmics globals, l'anàlisi quantitativa va confirmar que la hipoxantina i la xantina, el piruvat i el lactat estaven augmentats en LA en comparació amb BN i HC (Fig. 5b, c, p <0,05). Tanmateix, no es van trobar diferències significatives en aquests metabòlits entre BN i HC.
Anàlisi d'enriquiment de la via KEGG de metabòlits significativament diferents en el grup LA en comparació amb els grups BN i HC. Es va utilitzar un Globaltest bilateral i els valors de p es van ajustar mitjançant el mètode Holm-Bonferroni (p ajustada ≤ 0,001 i mida de l'efecte > 0,01). b–d Gràfics de violí que mostren els nivells d'hipoxantina, xantina, lactat, piruvat i triptòfan en HC, BN i LA sèrics determinats per LC-MS/MS (n = 70 per grup). Les línies de punts blanques i negres indiquen la mitjana i el quartil, respectivament. e Gràfic de violí que mostra l'expressió d'ARNm Log2TPM (transcrits per milió) normalitzada de SLC7A5 i QPRT en adenocarcinoma pulmonar (n = 513) en comparació amb el teixit pulmonar normal (n = 59) al conjunt de dades LUAD-TCGA. El quadre blanc representa el rang interquartílic, la línia negra horitzontal al centre representa la mediana i la línia negra vertical que s'estén des del quadre representa l'interval de confiança (IC) del 95%. f Gràfic de correlació de Pearson de l'expressió de SLC7A5 i GAPDH en adenocarcinoma pulmonar (n = 513) i teixit pulmonar normal (n = 59) al conjunt de dades TCGA. L'àrea grisa representa l'IC del 95%. r, coeficient de correlació de Pearson. g Nivells cel·lulars normalitzats de triptòfan en cèl·lules A549 transfectades amb control shRNA inespecífic (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) determinats per LC-MS/MS. Es presenta l'anàlisi estadística de cinc mostres biològicament independents de cada grup. h Nivells cel·lulars de NADt (NAD total, incloent-hi NAD+ i NADH) en cèl·lules A549 (NC) i cèl·lules A549 amb SLC7A5 knockdown (Sh1, Sh2). Es presenta l'anàlisi estadística de tres mostres biològicament independents de cada grup. i L'activitat glucolítica de les cèl·lules A549 abans i després de la inactivació de SLC7A5 es va mesurar mitjançant la taxa d'acidificació extracel·lular (ECAR) (n = 4 mostres biològicament independents per grup). 2-DG,2-desoxi-D-glucosa. Es va utilitzar la prova t de Student bilateral a (b-h). A (g-i), les barres d'error representen la mitjana ± SD, cada experiment es va realitzar tres vegades de manera independent i els resultats van ser similars. Les dades font es proporcionen en forma de fitxers de dades font.
Considerant l'impacte significatiu del metabolisme alterat del triptòfan en el grup LA, també vam avaluar els nivells sèrics de triptòfan en els grups HC, BN i LA mitjançant QQQ. Vam trobar que el triptòfan sèric es va reduir a LA en comparació amb HC o BN (p < 0,001, Figura 5d), la qual cosa és coherent amb troballes prèvies que els nivells circulants de triptòfan són més baixos en pacients amb càncer de pulmó que en controls sans del grup de control33,34,35. Un altre estudi que va utilitzar el traçador PET/TC 11C-metil-L-triptòfan va trobar que el temps de retenció del senyal del triptòfan en el teixit de càncer de pulmó va augmentar significativament en comparació amb les lesions benignes o el teixit normal36. La nostra hipòtesi és que la disminució del triptòfan en el sèrum de LA pot reflectir l'absorció activa de triptòfan per part de les cèl·lules de càncer de pulmó.
També se sap que el producte final de la via de la quinurenina del catabolisme del triptòfan és el NAD+37,38, que és un substrat important per a la reacció del gliceraldehid-3-fosfat amb l'1,3-bisfosfoglicerat en la glucòlisi39. Mentre que estudis anteriors s'han centrat en el paper del catabolisme del triptòfan en la regulació immunitària, nosaltres vam intentar elucidar la interacció entre la desregulació del triptòfan i les vies glucolítiques observades en l'estudi actual. Se sap que el membre 5 de la família de transportadors de soluts 7 (SLC7A5) és un transportador de triptòfan43,44,45. La fosforibosiltransferasa de l'àcid quinolinic (QPRT) és un enzim situat aigües avall de la via de la quinurenina que converteix l'àcid quinolinic en NAMN46. La inspecció del conjunt de dades LUAD TCGA va revelar que tant SLC7A5 com QPRT estaven significativament sobreexpressats en el teixit tumoral en comparació amb el teixit normal (Fig. 5e). Aquest augment es va observar en les etapes I i II, així com en les etapes III i IV de l'adenocarcinoma pulmonar (Figura suplementària 11), cosa que indica alteracions primerenques en el metabolisme del triptòfan associades a la tumorigènesi.
A més, el conjunt de dades LUAD-TCGA va mostrar una correlació positiva entre l'expressió de l'ARNm de SLC7A5 i GAPDH en mostres de pacients amb càncer (r = 0,45, p = 1,55E-26, Figura 5f). En canvi, no es va trobar cap correlació significativa entre aquestes signatures gèniques en el teixit pulmonar normal (r = 0,25, p = 0,06, Figura 5f). La supressió de SLC7A5 (Figura suplementària 12) en cèl·lules A549 va reduir significativament els nivells cel·lulars de triptòfan i NAD(H) (Figura 5g,h), donant lloc a una activitat glucolítica atenuada mesurada per la taxa d'acidificació extracel·lular (ECAR) (Figura 1). 5i). Així, basant-nos en els canvis metabòlics en el sèrum i la detecció in vitro, plantegem la hipòtesi que el metabolisme del triptòfan pot produir NAD+ a través de la via de la quinurenina i tenir un paper important en la promoció de la glucòlisi en el càncer de pulmó.
Els estudis han demostrat que un gran nombre de nòduls pulmonars indeterminats detectats mitjançant TC de baixa densitat (LDTC) pot comportar la necessitat de proves addicionals com ara PET-TC, biòpsia pulmonar i sobretractament a causa d'un diagnòstic fals positiu de malignitat.31 Com es mostra a la figura 6, el nostre estudi va identificar un panell de metabòlits sèrics amb potencial valor diagnòstic que pot millorar l'estratificació del risc i el maneig posterior dels nòduls pulmonars detectats per TC.
Els nòduls pulmonars s'avaluen mitjançant tomografia computada de dosi baixa (TCBD) amb característiques d'imatge que suggereixen causes benignes o malignes. El resultat incert dels nòduls pot conduir a visites de seguiment freqüents, intervencions innecessàries i sobretractament. La inclusió de classificadors metabòlics sèrics amb valor diagnòstic pot millorar l'avaluació del risc i el maneig posterior dels nòduls pulmonars. Tomografia per emissió de positrons PET.
Les dades de l'estudi NLST dels EUA i de l'estudi europeu NELSON suggereixen que el cribratge de grups d'alt risc amb tomografia computada de dosi baixa (LDCT) pot reduir la mortalitat per càncer de pulmó1,3. Tanmateix, l'avaluació del risc i la posterior gestió clínica d'un gran nombre de nòduls pulmonars incidentals detectats mitjançant LDCT continuen sent els més difícils. L'objectiu principal és optimitzar la classificació correcta dels protocols existents basats en LDCT mitjançant la incorporació de biomarcadors fiables.
Alguns biomarcadors moleculars, com ara els metabòlits sanguinis, s'han identificat comparant el càncer de pulmó amb controls sans15,17. En l'estudi actual, ens hem centrat en l'aplicació de l'anàlisi metabolòmica sèrica per distingir entre nòduls pulmonars benignes i malignes detectats incidentalment mitjançant LDCT. Vam comparar el metaboloma sèric global de mostres de control sa (HC), nòduls pulmonars benignes (BN) i adenocarcinoma pulmonar (AL) en estadi I mitjançant l'anàlisi UPLC-HRMS. Vam trobar que l'HC i el BN tenien perfils metabòlics similars, mentre que l'AL va mostrar canvis significatius en comparació amb l'HC i el BN. Vam identificar dos conjunts de metabòlits sèrics que diferencien l'AL de l'HC i el BN.
L'esquema d'identificació actual basat en la LDCT per a nòduls benignes i malignes es basa principalment en la mida, la densitat, la morfologia i la taxa de creixement dels nòduls al llarg del temps30. Estudis previs han demostrat que la mida dels nòduls està estretament relacionada amb la probabilitat de càncer de pulmó. Fins i tot en pacients d'alt risc, el risc de malignitat en ganglis <6 mm és <1%. El risc de malignitat per a nòduls que mesuren de 6 a 20 mm oscil·la entre el 8% i el 64%30. Per tant, la Fleischner Society recomana un diàmetre de tall de 6 mm per al seguiment rutinari de la TC.29 Tanmateix, l'avaluació del risc i el maneig dels nòduls pulmonars indeterminats (NPI) superiors a 6 mm no s'han realitzat adequadament31. El maneig actual de les cardiopaties congènites sol basar-se en l'expectativa vigilant amb monitorització freqüent per TC.
Basant-nos en el metaboloma validat, vam demostrar per primera vegada la superposició de signatures metabolòmiques entre individus sans i nòduls benignes <6 mm. La similitud biològica és coherent amb troballes prèvies de la TC que el risc de malignitat per a nòduls <6 mm és tan baix com per a subjectes sense nòduls.30 Cal destacar que els nostres resultats també demostren que els nòduls benignes <6 mm i ≥6 mm tenen una alta similitud en els perfils metabolòmics, cosa que suggereix que la definició funcional de l'etiologia benigna és coherent independentment de la mida del nòdul. Per tant, els panells moderns de metabòlits sèrics de diagnòstic poden proporcionar un únic assaig com a prova de descart quan els nòduls es detecten inicialment a la TC i potencialment reduir el seguiment en sèrie. Al mateix temps, el mateix panell de biomarcadors metabòlics va distingir els nòduls malignes de mida ≥6 mm dels nòduls benignes i va proporcionar prediccions precises per a NPI de mida similar i característiques morfològiques ambigües a les imatges de TC. Aquest classificador del metabolisme sèric va tenir un bon rendiment en la predicció de la malignitat dels nòduls ≥6 mm amb una AUC de 0,927. En conjunt, els nostres resultats indiquen que les signatures metabolòmiques sèriques úniques poden reflectir específicament els canvis metabòlics induïts per tumors primerencs i tenir un valor potencial com a predictors de risc, independentment de la mida del nòdul.
Cal destacar que l'adenocarcinoma de pulmó (LUAD) i el carcinoma de cèl·lules escamoses (LUSC) són els principals tipus de càncer de pulmó no microcític (NSCLC). Atès que el LUSC està fortament associat amb el consum de tabac47 i el LUAD és la histologia més comuna de nòduls pulmonars incidentals detectats en la TC48, el nostre model classificador es va construir específicament per a mostres d'adenocarcinoma en estadi I. Wang i els seus col·legues també es van centrar en el LUAD i van identificar nou signatures lipídiques mitjançant la lipidòmica per distingir el càncer de pulmó en estadi inicial dels individus sans17. Vam provar el model classificador actual en 16 casos de LUSC en estadi I i 74 nòduls benignes i vam observar una baixa precisió de predicció de LUSC (AUC 0,776), cosa que suggereix que el LUAD i el LUSC poden tenir les seves pròpies signatures metabolòmiques. De fet, s'ha demostrat que el LUAD i el LUSC difereixen en l'etiologia, l'origen biològic i les aberracions genètiques49. Per tant, s'haurien d'incloure altres tipus d'histologia en els models d'entrenament per a la detecció poblacional del càncer de pulmó en els programes de cribratge.
Aquí, vam identificar les sis vies alterades més freqüentment en l'adenocarcinoma de pulmó en comparació amb controls sans i nòduls benignes. La xantina i la hipoxantina són metabòlits comuns de la via metabòlica de les purines. D'acord amb els nostres resultats, els intermediaris associats amb el metabolisme de les purines van augmentar significativament en el sèrum o els teixits de pacients amb adenocarcinoma de pulmó en comparació amb controls sans o pacients en fase preinvasiva15,50. Els nivells elevats de xantina i hipoxantina sèriques poden reflectir l'anabolisme que requereixen les cèl·lules canceroses que proliferen ràpidament. La desregulació del metabolisme de la glucosa és una característica ben coneguda del metabolisme del càncer51. Aquí, vam observar un augment significatiu del piruvat i el lactat en el grup LA en comparació amb el grup HC i BN, la qual cosa és coherent amb informes anteriors d'anomalies de la via glucòtica en els perfils del metaboloma sèric de pacients amb càncer de pulmó de cèl·lules no petites (NSCLC) i controls sans. Els resultats són consistents52,53.
És important destacar que vam observar una correlació inversa entre el metabolisme del piruvat i del triptòfan en el sèrum dels adenocarcinomes pulmonars. Els nivells sèrics de triptòfan es van reduir en el grup LA en comparació amb el grup HC o BN. Curiosament, un estudi previ a gran escala amb una cohort prospectiva va trobar que els nivells baixos de triptòfan circulant s'associaven amb un major risc de càncer de pulmó 54. El triptòfan és un aminoàcid essencial que obtenim completament dels aliments. Concloem que la depleció de triptòfan sèric en l'adenocarcinoma pulmonar pot reflectir una ràpida depleció d'aquest metabòlit. És ben sabut que el producte final del catabolisme del triptòfan a través de la via de la quinurenina és la font de la síntesi de novo de NAD+. Com que el NAD+ es produeix principalment a través de la via de recuperació, la importància del NAD+ en el metabolisme del triptòfan en la salut i la malaltia encara s'ha de determinar46. La nostra anàlisi de la base de dades TCGA va mostrar que l'expressió del transportador de soluts del transportador de triptòfan 7A5 (SLC7A5) va augmentar significativament en l'adenocarcinoma de pulmó en comparació amb els controls normals i es va correlacionar positivament amb l'expressió de l'enzim glucolític GAPDH. Estudis anteriors s'han centrat principalment en el paper del catabolisme del triptòfan en la supressió de la resposta immunitària antitumoral40,41,42. Aquí demostrem que la inhibició de la captació de triptòfan per la inhibició de SLC7A5 en cèl·lules de càncer de pulmó provoca una disminució posterior dels nivells de NAD cel·lular i una atenuació concomitant de l'activitat glucolítica. En resum, el nostre estudi proporciona una base biològica per als canvis en el metabolisme sèric associats amb la transformació maligna de l'adenocarcinoma de pulmó.
Les mutacions de l'EGFR són les mutacions impulsores més comunes en pacients amb NSCLC. En el nostre estudi, vam trobar que els pacients amb mutació de l'EGFR (n = 41) tenien perfils metabolòmics generals similars als pacients amb EGFR de tipus salvatge (n = 31), tot i que vam trobar nivells sèrics disminuïts d'alguns pacients amb mutació de l'EGFR en pacients amb acilcarnitina. La funció establerta de les acilcarnitines és transportar grups acil del citoplasma a la matriu mitocondrial, cosa que condueix a l'oxidació dels àcids grassos per produir energia 55. D'acord amb les nostres troballes, un estudi recent també va identificar perfils de metaboloma similars entre tumors mutants de l'EGFR i de tipus salvatge de l'EGFR analitzant el metaboloma global de 102 mostres de teixit d'adenocarcinoma pulmonar 50. Curiosament, també es va trobar contingut d'acilcarnitina en el grup mutant de l'EGFR. Per tant, si els canvis en els nivells d'acilcarnitina reflecteixen els canvis metabòlics induïts per l'EGFR i les vies moleculars subjacents pot merèixer un estudi més aprofundit.
En conclusió, el nostre estudi estableix un classificador metabòlic sèric per al diagnòstic diferencial dels nòduls pulmonars i proposa un flux de treball que pot optimitzar l'avaluació del risc i facilitar la gestió clínica basada en el cribratge per tomografia computada.
Aquest estudi va ser aprovat pel Comitè d'Ètica de l'Hospital Oncològic de la Universitat Sun Yat-sen, el Primer Hospital Afiliat de la Universitat Sun Yat-sen i el Comitè d'Ètica de l'Hospital Oncològic de la Universitat Zhengzhou. En els grups de descobriment i validació interna, es van recollir 174 sèrums d'individus sans i 244 sèrums de nòduls benignes d'individus que se sotmetien a revisions mèdiques anuals al Departament de Control i Prevenció del Càncer del Centre Oncològic de la Universitat Sun Yat-sen, i 166 sèrums de nòduls benignes. Els adenocarcinomes pulmonars en estadi I es van recollir del Centre Oncològic de la Universitat Sun Yat-sen. A la cohort de validació externa, hi va haver 48 casos de nòduls benignes, 39 casos d'adenocarcinoma pulmonar en estadi I del Primer Hospital Afiliat de la Universitat Sun Yat-sen i 24 casos d'adenocarcinoma pulmonar en estadi I de l'Hospital Oncològic de Zhengzhou. El Centre Oncològic de la Universitat Sun Yat-sen també va recollir 16 casos de càncer de pulmó escamós en estadi I per provar la capacitat diagnòstica del classificador metabòlic establert (les característiques dels pacients es mostren a la Taula Suplementària 5). Es van recollir mostres de la cohort de descobriment i de la cohort de validació interna entre gener de 2018 i maig de 2020. Les mostres de la cohort de validació externa es van recollir entre agost de 2021 i octubre de 2022. Per minimitzar el biaix de gènere, es va assignar un nombre aproximadament igual de casos masculins i femenins a cada cohort. Equip de Descobriment i Equip de Revisió Interna. El sexe dels participants es va determinar a partir de l'autoinforme. Es va obtenir el consentiment informat de tots els participants i no es va proporcionar cap compensació. Els subjectes amb nòduls benignes eren aquells amb una puntuació de TC estable als 2 a 5 anys en el moment de l'anàlisi, excepte 1 cas de la mostra de validació externa, que es va recollir preoperatòriament i es va diagnosticar mitjançant histopatologia. Amb l'excepció de la bronquitis crònica. Els casos d'adenocarcinoma pulmonar es van recollir abans de la resecció pulmonar i es van confirmar mitjançant diagnòstic patològic. Es van recollir mostres de sang en dejú en tubs de separació de sèrum sense anticoagulants. Les mostres de sang es van coagular durant 1 hora a temperatura ambient i després es van centrifugar a 2851 × g durant 10 minuts a 4 °C per recollir el sobrenedant de sèrum. Les alíquotes de sèrum es van congelar a -80 °C fins a l'extracció dels metabòlits. El Departament de Prevenció del Càncer i Examen Mèdic del Centre Oncològic de la Universitat Sun Yat-sen va recollir un conjunt de sèrum de 100 donants sans, incloent-hi un nombre igual d'homes i dones d'entre 40 i 55 anys. Es van barrejar volums iguals de cada mostra de donant, el conjunt resultant es va alíquotar i es va emmagatzemar a -80 °C. La barreja de sèrum es va utilitzar com a material de referència per al control de qualitat i l'estandardització de dades.
El sèrum de referència i les mostres de prova es van descongelar i els metabòlits es van extreure mitjançant un mètode d'extracció combinat (MTBE/metanol/aigua) 56. Breument, es van barrejar 50 μl de sèrum amb 225 μl de metanol gelat i 750 μl de metil tert-butilèter (MTBE) gelat. Es va remenar la barreja i es va incubar en gel durant 1 hora. A continuació, es van barrejar les mostres i es van vortexar amb 188 μl d'aigua de grau MS que contenia estàndards interns (13C-lactat, 13C3-piruvat, 13C-metionina i 13C6-isoleucina, adquirits a Cambridge Isotope Laboratories). A continuació, la barreja es va centrifugar a 15.000 × g durant 10 min a 4 °C i la fase inferior es va transferir a dos tubs (125 μL cadascun) per a l'anàlisi LC-MS en modes positiu i negatiu. Finalment, la mostra es va evaporar fins a sequedat en un concentrador de buit d'alta velocitat.
Els metabòlits secs es van reconstituir en 120 μl d'acetonitril al 80%, es van vortexar durant 5 min i es van centrifugar a 15.000 × g durant 10 min a 4 °C. Els sobrenadants es van transferir a vials de vidre ambre amb microinsercions per a estudis metabolòmics. Anàlisi metabolòmica no dirigida en una plataforma de cromatografia líquida d'ultra rendiment-espectrometria de masses d'alta resolució (UPLC-HRMS). Els metabòlits es van separar mitjançant un sistema Dionex Ultimate 3000 UPLC i una columna d'amida ACQUITY BEH (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters). En mode d'ions positius, les fases mòbils eren 95% (A) i 50% d'acetonitril (B), cadascuna contenint 10 mmol/L d'acetat d'amoni i 0,1% d'àcid fòrmic. En mode negatiu, les fases mòbils A i B contenien un 95% i un 50% d'acetonitril, respectivament, ambdues fases contenien 10 mmol/L d'acetat d'amoni, pH = 9. El programa de gradient va ser el següent: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. La columna es va mantenir a 40 °C i la mostra a 10 °C al mostrejador automàtic. El cabal va ser de 0,3 ml/min i el volum d'injecció va ser de 3 μl. Un espectròmetre de masses Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) amb una font d'ionització per electroaspersió (ESI) es va operar en mode d'escaneig complet i es va acoblar al mode de monitorització ddMS2 per recopilar grans volums de dades. Els paràmetres MS es van establir de la manera següent: voltatge d'aspersió +3,8 kV/- 3,2 kV, temperatura capil·lar 320 °C, gas de protecció 40 arb, gas auxiliar 10 arb, temperatura de l'escalfador de la sonda 350 °C, rang d'escaneig 70–1050 m/h, resolució . 70.000. Les dades es van adquirir mitjançant Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Per avaluar la qualitat de les dades, es van generar mostres de control de qualitat (QC) agrupades eliminant alíquotes de 10 μL del sobrenedant de cada mostra. Es van analitzar sis injeccions de mostres de control de qualitat al començament de la seqüència analítica per avaluar l'estabilitat del sistema UPLC-MS. A continuació, s'introdueixen periòdicament mostres de control de qualitat al lot. Els 11 lots de mostres de sèrum d'aquest estudi van ser analitzats mitjançant LC-MS. Es van utilitzar alíquotes d'una barreja agrupada de sèrum de 100 donants sans com a material de referència en els lots respectius per controlar el procés d'extracció i ajustar els efectes lot a lot. Es va realitzar una anàlisi metabolòmica no dirigida de la cohort de descobriment, la cohort de validació interna i la cohort de validació externa al Centre de Metabolòmica de la Universitat Sun Yat-sen. El laboratori extern del Centre d'Anàlisi i Proves de la Universitat Tecnològica de Guangdong també va analitzar 40 mostres de la cohort externa per provar el rendiment del model classificador.
Després de l'extracció i la reconstitució, la quantificació absoluta dels metabòlits sèrics es va mesurar mitjançant cromatografia líquida d'ultraalta resolució-espectrometria de masses en tàndem (Agilent 6495 triple quadrupol) amb una font d'ionització per electroaspersió (ESI) en mode de monitorització de reaccions múltiples (MRM). Es va utilitzar una columna d'amida ACQUITY BEH (2,1 × 100 mm, 1,7 μm, Waters) per separar els metabòlits. La fase mòbil consistia en un 90% (A) i un 5% d'acetonitril (B) amb una solució d'acetat d'amoni a 10 mmol/L i un 0,1% d'amoníac. El programa de gradient va ser el següent: 0–1,5 min, 0% B; 1,5–6,5 min, 0–15% B; 6,5–8 min, 15% B; 8–8,5 min, 15%–0% B; 8,5–11,5 min, 0% B. La columna es va mantenir a 40 °C i la mostra a 10 °C al mostrejador automàtic. El cabal va ser de 0,3 mL/min i el volum d'injecció va ser d'1 μL. Els paràmetres de MS es van establir de la manera següent: voltatge capil·lar ±3,5 kV, pressió del nebulitzador 35 psi, flux de gas de la funda 12 L/min, temperatura del gas de la funda 350 °C, temperatura del gas d'assecat 250 °C i flux de gas d'assecat 14 l/min. Les conversions MRM de triptòfan, piruvat, lactat, hipoxantina i xantina van ser 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 i 151,0–107,9 respectivament. Les dades es van recollir mitjançant Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Per a les mostres de sèrum, el triptòfan, el piruvat, el lactat, la hipoxantina i la xantina es van quantificar mitjançant corbes de calibratge de solucions de mescla estàndard. Per a les mostres cel·lulars, el contingut de triptòfan es va normalitzar respecte a l'estàndard intern i la massa de proteïna cel·lular.
L'extracció de pics (m/z i temps de retenció (RT)) es va dur a terme mitjançant Compound Discovery 3.1 i TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Per eliminar possibles diferències entre lots, cada pic característic de la mostra de prova es va dividir pel pic característic del material de referència del mateix lot per obtenir l'abundància relativa. Les desviacions estàndard relatives dels estàndards interns abans i després de l'estandardització es mostren a la Taula Suplementària 6. Les diferències entre els dos grups es van caracteritzar per la taxa de descobriment fals (FDR <0,05, prova de rang amb signe de Wilcoxon) i el canvi de plegament (> 1,2 o <0,83). Les dades de MS en brut de les característiques extretes i les dades de MS corregides amb sèrum de referència es mostren a les Dades Suplementàries 1 i Dades Suplementàries 2, respectivament. L'anotació de pics es va realitzar basant-se en quatre nivells d'identificació definits, incloent-hi metabòlits identificats, compostos putativament anotats, classes de compostos putativament caracteritzades i compostos desconeguts 22. Basant-se en cerques a la base de dades de Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), finalment es van seleccionar compostos biològics amb estàndards validats coincidents amb MS/MS o anotacions de coincidència exacta a mzCloud (puntuació > 85) o Chemspider com a intermedis entre el metaboloma diferencial. Les anotacions màximes per a cada característica s'inclouen a les dades suplementàries 3. Es va utilitzar MetaboAnalyst 5.0 per a l'anàlisi univariant de l'abundància de metabòlits normalitzats per suma. MetaboAnalyst 5.0 també va avaluar l'anàlisi d'enriquiment de la via KEGG basada en metabòlits significativament diferents. L'anàlisi de components principals (PCA) i l'anàlisi discriminant per mínims quadrats parcials (PLS-DA) es van analitzar mitjançant el paquet de programari ropls (v.1.26.4) amb normalització de pila i autoescalat. El model òptim de biomarcadors de metabòlits per predir la malignitat dels nòduls es va generar mitjançant la regressió logística binària amb la mínima contracció absoluta i l'operador de selecció (LASSO, paquet R v.4.1-3). El rendiment del model discriminant en els conjunts de detecció i validació es va caracteritzar mitjançant l'estimació de l'AUC basada en l'anàlisi ROC segons el paquet pROC (v.1.18.0.). El tall de probabilitat òptim es va obtenir en funció de l'índex de Youden màxim del model (sensibilitat + especificitat – 1). Les mostres amb valors inferiors o superiors al llindar es prediran com a nòduls benignes i adenocarcinoma de pulmó, respectivament.
Les cèl·lules A549 (#CCL-185, American Type Culture Collection) es van cultivar en un medi F-12K que contenia un 10% de FBS. Es van inserir seqüències d'ARN de forquilla curta (shRNA) dirigides a SLC7A5 i un control no dirigit (NC) al vector lentiviral pLKO.1-puro. Les seqüències antisentit de shSLC7A5 són les següents: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Els anticossos contra SLC7A5 (#5347) i tubulina (#2148) es van comprar a Cell Signaling Technology. Els anticossos contra SLC7A5 i tubulina es van utilitzar a una dilució d'1:1000 per a l'anàlisi de Western blot.
La prova d'estrès glucolític Seahorse XF mesura els nivells d'acidificació extracel·lular (ECAR). En l'assaig, es van administrar glucosa, oligomicina A i 2-DG seqüencialment per provar la capacitat glucolítica cel·lular mesurada per ECAR.
Les cèl·lules A549 transfectades amb control no dirigit (NC) i shSLC7A5 (Sh1, Sh2) es van sembrar durant la nit en plaques de 10 cm de diàmetre. Els metabòlits cel·lulars es van extreure amb 1 ml de metanol aquós al 80% fred amb gel. Les cèl·lules de la solució de metanol es van raspar, es van recollir en un tub nou i es van centrifugar a 15.000 × g durant 15 min a 4 °C. Es van recollir 800 µl de sobrenedant i es van assecar amb un concentrador de buit d'alta velocitat. A continuació, es van analitzar els nivells de triptòfan dels pellets de metabòlits secs mitjançant LC-MS/MS, tal com s'ha descrit anteriorment. Els nivells de NAD(H) cel·lular a les cèl·lules A549 (NC i shSLC7A5) es van mesurar mitjançant un kit colorimètric quantitatiu de NAD+/NADH (#K337, BioVision) segons les instruccions del fabricant. Els nivells de proteïnes es van mesurar per a cada mostra per normalitzar la quantitat de metabòlits.
No es van utilitzar mètodes estadístics per determinar preliminarment la mida de la mostra. Els estudis metabolòmics previs dirigits al descobriment de biomarcadors15,18 s'han considerat com a punts de referència per a la determinació de la mida i, en comparació amb aquests informes, la nostra mostra era adequada. No es va excloure cap mostra de la cohort d'estudi. Les mostres sèriques es van assignar aleatòriament a un grup de descobriment (306 casos, 74,6%) i a un grup de validació interna (104 casos, 25,4%) per a estudis metabolòmics no dirigits. També vam seleccionar aleatòriament 70 casos de cada grup del conjunt de descobriment per a estudis metabolòmics dirigits. Els investigadors estaven cecs a l'assignació de grups durant la recollida i l'anàlisi de dades de LC-MS. Les anàlisis estadístiques de les dades metabolòmiques i els experiments cel·lulars es descriuen a les respectives seccions de Resultats, Llegendes de figures i Mètodes. La quantificació del triptòfan cel·lular, el NADT i l'activitat glucolítica es va realitzar tres vegades de manera independent amb resultats idèntics.
Per obtenir més informació sobre el disseny de l'estudi, consulteu el resum de l'informe Natural Portfolio associat a aquest article.
Les dades MS en brut de les característiques extretes i les dades MS normalitzades del sèrum de referència es mostren a les dades suplementàries 1 i 2, respectivament. Les anotacions dels pics per a les característiques diferencials es presenten a les dades suplementàries 3. El conjunt de dades LUAD TCGA es pot descarregar des de https://portal.gdc.cancer.gov/. Les dades d'entrada per traçar el gràfic es proporcionen a les dades font. Les dades font es proporcionen per a aquest article.
Grup Nacional d'Estudi de Cribratge Pulmonar, etc. Reducció de la mortalitat per càncer de pulmó amb tomografia computada de dosis baixes. Nord d'Anglaterra. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR i Prophet, PC Cribratge del càncer de pulmó mitjançant TC helicoïdal de dosi baixa: resultats de l'Estudi Nacional de Cribratge Pulmonar (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Reducció de la mortalitat per càncer de pulmó amb cribratge per TC volumètrica en un assaig aleatoritzat. Nord d'Anglaterra. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Data de publicació: 18 de setembre de 2023