CRISPR) és una tècnica d'edició del genoma de tercera generació: CRISPR va revolucionar el món

Les repeticions palindròmiques curtes agrupades i regularment espaiades (CRISPR) són una tècnica d'edició del genoma de tercera generació que ha revolucionat el món amb els seus resultats d'alt rendiment. S'ha utilitzat per tractar diverses malalties i infeccions biològiques. Diversos bacteris i altres procariotes (com les arquees) també tenen sistemes CRISPR/Cas9 per defensar-se contra els fagos. S'ha informat que les estratègies basades en CRISPR/Cas9 poden inhibir el creixement i la progressió del càncer de mama triple negatiu (TNBC) dirigint-se a gens de resistència potencialment alterats, transcripció i regulació epigenètica. Aquestes intervencions terapèutiques poden ajudar a abordar problemes difícils com la resistència als fàrmacs observada fins i tot en TNBC. Actualment, s'utilitzen diversos mètodes per administrar CRISPR/Cas9 a les cèl·lules diana, com ara físics (microinjecció, electroporació i modes hidrodinàmics), virals (virus adenoassociats i lentivirus) i no virals (liposomes i nanopartícules lipídiques). )-partícules). Tot i que s'han desenvolupat diversos models per estudiar les causes moleculars del TNBC, la manca de mètodes sensibles i dirigits per a l'aplicació d'eines d'edició del genoma in vivo limita la seva aplicació clínica. En resum, aquesta revisió examina exhaustivament el progrés, els reptes, les limitacions i les perspectives del tractament CRISPR/Cas9 per al TNBC basant-se en l'evidència existent. També destaquem com la combinació d'intel·ligència artificial i aprenentatge automàtic pot millorar les estratègies CRISPR/Cas9 en el tractament del TNBC.
El càncer es caracteritza per una divisió cel·lular incontrolada, la interrupció dels punts de control del cicle cel·lular i mutacions en gens supressors de tumors (TSG) (Matthews et al., 2022). Entre els diferents tipus de càncer, el càncer de mama és el tipus de càncer més comú en les dones i té una alta taxa de mortalitat a tot el món (Waks i Winer, 2019). El càncer de mama és una malaltia heterogènia amb característiques diverses, com ara les característiques histològiques i biològiques, la presentació i el comportament clínic, i la resposta al tractament (Weigelt et al., 2010). La classificació del càncer de mama proporciona informació precisa per al diagnòstic del càncer de mama i el pronòstic tumoral. L'ús de biomarcadors comuns i característiques clinicopatològiques ha estat el criteri principal per a la classificació del càncer de mama (Tsang i Tse, 2019). El pronòstic i la resposta al tractament del càncer de mama estan influenciats per nombrosos factors, com ara la presència del receptor d'estrogen (ER), el receptor de progesterona (PR), el receptor 2 del factor de creixement epidèrmic humà (HER2/neu) i el grau histològic, el tipus de tumor i el grau. mida i metàstasi als ganglis limfàtics (Al-Tubaiti, 2020). S'han identificat cinc subtipus moleculars intrínsecs de càncer de mama, incloent-hi el luminal A, el luminal B, l'enriquit amb HER2, el basal i el claudina-baix (Prat et al., 2015). El TNBC és un subtipus molecular de càncer que no expressa tots els ER, PR i HER2 (Yin et al., 2020). Aquestes característiques patològiques s'associen amb el TNBC, confirmant la seva ràpida progressió i la seva naturalesa més agressiva que qualsevol altre tipus de càncer de mama (Feng et al., 2018). A més, Peru et al. (2000) van utilitzar la tecnologia de microarrays per reclassificar el càncer de mama i identificar cinc subtipus intrínsecs de càncer de mama (Cadenas, 2012). El càncer de mama basal és un subtipus de càncer de mama que té un fenotip triple negatiu i s'associa amb una progressió ràpida. Cal destacar que tots els càncers de mama de tipus basal es solen diagnosticar erròniament com a CMTN, però només el 77% són CMTN; En canvi, entre el 71 i el 91% dels CMTN són de tipus basal, cosa que indica que aquests dos tipus de càncer de mama se superposen i representen classificacions diferents (Wang D.-Y. et al., 2019). Això crea la necessitat de caracteritzar l'heterogeneïtat del CMTN per elucidar el pronòstic i identificar possibles respostes als tractaments actuals i futurs. A més, el CMTN representa entre el 15 i el 20% de tots els casos de càncer de mama i és més freqüent en dones menors de 50 anys. S'han reportat mutacions BRCA1 o BRCA2 en aproximadament el 20% dels casos de CMTN (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Els estudis també han demostrat que el TNBC té un microambient immunitari distintiu que inclou alts nivells de factors de creixement endotelial vascular, macròfags associats a tumors (TAM), limfòcits infiltrants de tumors (TIL) i altres molècules implicades en el creixement i la migració tumoral. Per tant, comprendre el microambient del TNBC és fonamental per al seu pronòstic i tractament (Fan i He, 2022).
Per avaluar el pronòstic del càncer de mama trigemina (CMTN) i garantir un tractament eficaç, és important un diagnòstic precís, basat principalment en la immunohistoquímica (IHQ) per detectar RE, PR i HER2, i la mamografia per detectar neoplasmes mamars. Tanmateix, la mamografia no pot representar adequadament les característiques intratumorals com la necrosi i la fibrosi (Deepak Singh et al., 2021). Com que un mal pronòstic i diagnòstic impedeixen que els metges prescriguin els medicaments adequats (Chaudhary, 2020), s'utilitzen diverses estratègies per millorar l'atenció als pacients amb CMTN. Actualment, s'utilitzen dos fàrmacs, la doxorubicina i la ciclofosfamida, en pacients amb CMTN i han mostrat bons resultats. A més, s'utilitzen altres fàrmacs de platí, com el carboplatí i el cisplatí (Sikov et al., 2015). A més, els inhibidors de PARP com l'olaparib, el velaparib i el PF-01367338 s'han utilitzat com a possibles fàrmacs de quimioteràpia per al tractament del CMTN (Ishino et al., 2018). Com que s'ha informat que les vies de senyalització Wnt/b-catenina, NOTCH i Hedgehog estan implicades en l'aparició i la progressió del TNBC, dirigir els fàrmacs a aquestes vies pot ser una estratègia important (Aysola et al., 2013). Tot i que la cirurgia, la radioteràpia i la quimioteràpia continuen sent el pilar del tractament per al TNBC actualment, s'han fet progressos significatius en el desenvolupament de nous tractaments, com ara la teràpia dirigida, la immunoteràpia, diverses eines d'edició genètica relacionades amb CRISPR com ara Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, l'edició primària i la teràpia gènica dirigida a CRISPR/Cas9. Aquí ens centrarem en diverses eines d'edició genètica relacionades amb CRISPR que s'utilitzen en el tractament del TNBC. Entre elles, CRISPR/Cas9 ha rebut una àmplia atenció.
Cas9n, també coneguda com a Cas9 nickase, és una variant genèticament modificada de la proteïna Cas9 derivada del sistema d'edició del genoma CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). En la seva forma original, la proteïna Cas9 conté dos dominis nucleasa: RuvC i HNH, la funció principal dels quals és l'escissió d'ambdues cadenes d'ADN. Tanmateix, en Cas9n, un dels dominis nucleasa, HNH, muta genèticament i esdevé inactiu. Per tant, el domini HNH de Cas9n roman no funcional. Només el domini RuvC roman actiu, cosa que permet a Cas9n tallar o crear ruptures en cadenes d'ADN individuals (Trevino i Zhang, 2014). En comparació amb Cas9, Cas9n pot reduir eficaçment els efectes fora de l'objectiu i millorar amb precisió els mecanismes de reparació cel·lular. Cas9n es pot utilitzar per resoldre diversos problemes, com ara la creació de ruptures en ubicacions específiques de l'ADN bicatenari. Per a aquest propòsit, es van combinar dues molècules de Cas9n i es van utilitzar juntes (Yee, 2016). La cinasa de llinatge mixt 3 (MLK3) és una proteïna cinasa activada per mitògens que serveix com a regulador clau durant la metàstasi del TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 pot activar múltiples vies de senyalització que condueixen a la metàstasi del TNBC. Per exemple, la via de la cinasa N-terminal c-Jun (JNK) regula la motilitat cel·lular i la degradació de la matriu extracel·lular, i MLK3 activa la via JNK, millorant així la motilitat cel·lular i conferint propietats invasives (Rattanasinchai i Gallo, 2016). MLK3 també regula la EMT. Per fer-ho, activa factors de transcripció posteriors com ara Snail, Slug i Twist. Aquests factors inhibeixen l'expressió de marcadors epitelials i promouen l'expressió de marcadors mesenquimals, donant lloc a l'adquisició d'un fenotip metastàtic (Casalino et al., 2023). S'ha observat que MLK3 juga un paper en la remodelació de la matriu extracel·lular (ECM) i l'activació de proteases com les metal·loproteinases de matriu (MMP) que degraden la ECM. Això facilita la invasió de les cèl·lules tumorals i la propagació a llocs distants (Katari et al., 2019). Per tant, estudis previs han demostrat que MLK3 juga un paper crític en el TNBC. Rattanasinchai i Gallo van utilitzar models de TNBC per estudiar el paper de MLK3 i van descobrir que promou el desenvolupament del càncer a través de vies de senyalització específiques. Van utilitzar CRISPR/Cas9n per editar MLK3 i van observar una reducció significativa de la metàstasi de TNBC (Rattanasinchai i Gallo, 2016).
El dCas9, sovint anomenat Cas9 inactiu, és una forma derivada modificada de la proteïna Cas9. A diferència del Cas9 actiu, el dCas9 no té activitat endonucleasa, cosa que el fa incapaç d'induir trencaments de la doble cadena d'ADN. Per tant, el dCas9 es pot utilitzar per dirigir-se amb precisió a regions específiques del genoma sense cap canvi ni modificació a la seqüència d'ADN (Wang et al., 2016). En el dCas9, dues proteïnes endonucleases, RuvC i HNH, s'inactiven suprimint importants residus d'aminoàcids. (Richter et al., 2016). Malgrat la seva manca d'activitat d'escissió d'ADN, el dCas9 juga diversos papers importants en la investigació genètica i la biotecnologia. Per exemple, permet la visualització de regions específiques del genoma, facilita la regulació transcripcional i promou modificacions epigenètiques (Brocken et al., 2018).
El factor de transcripció ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) juga un paper específic i crític en la mediació de la transició epitelial-mesenquimal (TEM), un procés cel·lular que es produeix durant el desenvolupament embrionari, la reparació de teixits i la progressió del càncer. Implica la transformació de cèl·lules epitelials en cèl·lules mesenquimals, cosa que provoca canvis en la morfologia cel·lular, la motilitat, la invasió, etc. (Wu et al., 2020). ZEB1 inhibeix múltiples marcadors epitelials, com ara l'E-cadherina i l'ocludina, que són responsables de mantenir l'adhesió cèl·lula-cèl·lula i la polaritat de les cèl·lules epitelials en el TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). A més, ZEB1 activa certs marcadors com ara la N-cadherina, la vimentina i la fibronectina (Konradi et al., 2014) i també regula gens implicats en la remodelació del citoesquelet com ara les Rho GTPases i les metal·loproteinases de matriu (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), a més, també afecta diverses vies de senyalització com el factor de creixement transformant β (TGF-β), la senyalització Wnt, etc., promovent així la invasió tumoral i la metàstasi en el TNBC (Chen et al., 2016). Nombrosos estudis i evidències científiques indiquen que ZEB1 té un gran potencial com a agent valuós per a la detecció i la intervenció terapèutica del TNBC. En un estudi recent, Waryah et al. van utilitzar un model de TNBC i van aconseguir la supressió completa de ZEB1 per dCas9. Així, van observar una especificitat molt alta i una inhibició gairebé completa de ZEB1 en condicions in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 és una eina d'edició genètica anomenada CRISPR/Cpf1. Deriva del sistema CRISPR/Cas, on el terme Cas12 fa referència a la proteïna 12 associada a CRISPR (Bharathkumar et al., 2022), que és completament similar a Cas9. L'única diferència és que conté la proteïna Cas12. En comparació amb Cas9, Cas12 té algunes funcions úniques, com ara generar extrems enganxosos durant el procés d'edició genètica, mentre que Cas9 genera extrems roms (Wang et al., 2021). Aquesta propietat de Cas12 contribueix a la seva tecnologia específica de manipulació d'ADN. Com a proteïna capaç de reconèixer i tallar amb precisió l'ADN diana, té una versatilitat extraordinària, cosa que la converteix en una eina eficaç per a una varietat d'aplicacions, inclosa l'edició genètica (Pickar-Oliver i Gersbach, 2019).
De manera similar a altres variants de CRISPR, CRISPR/Cas12 també és capaç d'inactivar o activar gens en el TNBC, dirigint-se a gens que tenen un paper important en la seva patogènesi o resposta al tractament (Yang i Zhang, 2023). Per aconseguir aquest procés, es va desenvolupar un ARN guia (gRNA) que dirigeix ​​Cas12 al gen diana. Un cop Cas12 s'uneix a la seva diana, introdueix trencaments de doble cadena a l'ADN i activa els mecanismes de reparació de l'ADN. Durant el procés de reparació, es poden incorporar nucleòtids incorrectes, cosa que provoca mutacions gèniques i pèrdua de funció (Zhang et al., 2021a). A més, també es va utilitzar una versió millorada de l'enzim Cas12 (anomenada dCas12) per activar gens. Combinant-lo amb un activador de la transcripció, és possible induir certs gens, activant-los així. Aquesta tecnologia té un gran potencial per promoure l'activació de gens supressors de tumors (Sultan et al., 2022).
L'edició primària és una tecnologia d'edició del genoma recentment desenvolupada i extremadament superior. És capaç de modificar l'ADN d'un organisme amb molta precisió (Chen i Liu, 2023). L'edició primària s'aconsegueix mitjançant la integració de dos components principals: un enzim CRISPR/Cas9 modificat i una transcriptasa inversa. La funció de l'enzim CRISPR/Cas9 és dirigir-se selectivament a llocs precisos del genoma, mentre que la transcriptasa inversa ajuda a modificar completament l'ADN a la ubicació objectiu (Hassan et al., 2021). En el mecanisme d'edició d'encebadors, el primer pas implica la creació d'un ARN guia d'edició d'encebadors (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Conté la seqüència objectiu i la plantilla d'ARN corresponent al lloc d'edició desitjat a l'ADN objectiu. El pegRNA s'introdueix a les cèl·lules objectiu juntament amb una nucleasa d'edició d'encebadors (PE2). La PE2 és una proteïna de fusió que consisteix en un enzim Cas9, una transcriptasa inversa i un adaptador d'edició d'encebadors (Martín-Alonso et al., 2021). Dins de la cèl·lula, els complexos de pegRNA i PE2 busquen l'ADN específic que volen modificar. L'enzim Cas9 talla l'ADN i crea una plantilla que consisteix en cadenes simples (Choi et al., 2022). La transcriptasa inversa utilitza aquesta plantilla per preparar l'ADN per a l'edició. Juntament amb la còpia de l'ADN, també s'inclouen instruccions per editar la plantilla d'ARN. Finalment, la cadena d'ADN recentment creada s'utilitza com a plantilla per reparar la ruptura de l'ADN, donant lloc a una seqüència d'ADN alterada que conté la modificació desitjada (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Els mecanismes d'edició dels primers poden conduir a mutacions generalitzades en els gens. Pot atacar mutacions puntuals, insercions, delecions i fins i tot substitucions de gens (Anzalone et al., 2019; Chen i Liu, 2023). L'edició amb primers ofereix diversos avantatges respecte a les tecnologies anteriors d'edició del genoma. Aquests inclouen una major precisió, una reducció dels efectes fora de l'objectiu i la capacitat d'editar l'ADN sense dependre de les ruptures de la doble cadena de l'ADN (Anzalone et al., 2020).
La tecnologia CRISPR/Cas9 es va desenvolupar originalment per protegir els bacteris de la transferència de plasmidis i la infecció per fagos, i posteriorment es va reutilitzar com a eina eficaç de focalització de l'ADN basada en ARN per a l'edició del genoma (Jiang i Doudna, 2017). A més, s'ha informat que el sistema CRISPR/Cas9 és present en el 50% i el 87% dels genomes bacterians i arqueals, respectivament (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 és una eina potencial per a l'eliminació, inserció i correcció de qualsevol seqüència genètica anormal mitjançant modes in vivo i in vitro (Sabit et al., 2021). A més, s'ha demostrat que CRISPR/Cas9 forma part del sistema immunitari adaptatiu a causa de la seva especificitat per als gens diana d'interès (Chen i Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 consta de Cas9 i un únic ARN guia (sgRNA). Cas9 és una endonucleasa composta per múltiples components proteics. A més, Cas9 té propietats estructurals i conformacionals úniques (Pacesa et al., 2022), ja que consta de dos lòbuls: reconeixement (REC) i nucleasa (NUC). El lòbul REC es divideix al seu torn en tres regions: REC1, REC2 i hèlixs pont (Cromwell et al., 2018). El NUC consta de tres lòbuls, concretament RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH i el domini d'interacció del motiu adjacent al protoespaiador (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). L'sgRNA consta de dos components, que inclouen l'ARN CRISPR (crRNA) i l'ARN petit transcodificador (ARN traçador) (Figura 1). El sgRNA connecta la proteïna Cas9 a les connexines per formar un complex actiu, també conegut com a complex efector (Richter et al., 2012). El crRNA és un parell de bases de 18-20 nucleòtids que juga un paper crític en el reconeixement de les seqüències d'ADN diana. A més, el crRNA s'aparella amb l'ADN diana i el tracrRNA actua com a bastida perquè la nucleasa Cas9 s'uneixi a l'ADN diana (Manghwar et al., 2019). D'altra banda, la seqüència PAM té 3 nucleòtids, cosa que confirma, especifica i media la unió del complex efector a l'ADN. Les subunitats RuvC i HNH del complex proteic Cas9 tenen activitat catalítica (Richter et al., 2012; Asmamaw i Zawdie, 2021). El domini nucleasa HNH de la subunitat Cas9 talla la cadena d'ADN associada amb el crRNA. El domini nucleasa RuvC talla altres cadenes d'ADN i genera trencaments de doble cadena (DSB), després dels quals s'activen dos mecanismes diferents de reparació de trencaments d'ADN (Jiang i Doudna, 2017) (Figura 1).
Figura 1. Visió general de CRISPR/Cas9 (A). Components del sistema CRISPR/Cas9: (i). L'endonucleasa Cas9 és responsable de tallar la seqüència d'ADN diana, (ii) un únic ARN guia (sg) resultant de la fusió de quimeres crRNA i tra-crRNA. (dos). Cas9 inclou diversos components com ara Rec I, Rec II, el lòbul NUC (HNH i Ruv C són subcomponents) i el domini d'interacció PAM (C) amb les funcions corresponents. El complex proteic CRISPR/Cas9 divideix les seqüències d'ADN en formes no complementàries i complementàries (D). CRISPR/Cas9 edita el genoma en tres etapes: reconeixement, tall i reparació. L'sg-RNA dissenyat guia Cas9 i reconeix la seqüència desitjada a través del component complementari crRNA. Cas9 reconeix la seqüència PAM a 5′-NGG-3′ i fon l'ADN, formant un híbrid ADN-ARN i activant l'escissió. El domini HNH de Cas9 talla la cadena complementària, i el domini RuvC talla la cadena no complementària. CRISPR/Cas9 repara el dsDNA trencant-lo de dues maneres: unió d'extrems no homòlegs (NHEJ) i reparació dirigida per homologia (HDR). La NHEJ repara l'ADN bicatenari en absència d'ADN homòleg estrany mitjançant un procés enzimàtic, un mecanisme propens a errors que pot inserir o eliminar seqüències d'ADN aleatòries. La HDR és molt específica i requereix plantilles d'ADN homòlogues.
Les vies de reparació mediades per CRISPR/Cas9 inclouen mecanismes d'unió d'extrems no homòlegs (NHEJ) i de reparació dirigida per homologia (HDR). La NHEJ és una via propensa a errors perquè implica inserció o supressió i no requereix cap patró durant el mecanisme de reparació. Utilitza nucleòtids aleatoris per generar proteïnes estàndard (Abbasi et al., 2021). Aquest sistema de reparació consta de quatre complexos com el complex KU, el complex proteic de complementació creuada tipus 4 (XRCC-4), l'enzim de processament d'extrems d'ADN i la proteïna cinasa DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). La proteïna del complex KU té dues subunitats, Ku 70 i Ku 80, i juga un paper important en el mecanisme de la NHEJ, ja que el mecanisme de reparació s'inicia amb la unió de dues subunitats (Ku 70 i Ku 80) als extrems roms o gairebé roms de l'ADN diana (Abbasi et al., 2021), servint com a bastida per reclutar altres factors relacionats amb la NHEJ al lloc de la lesió (Yang et al., 2020). La XRCC-4 i l'ADN lligasa estan compostes per 334 i 911 aminoàcids, respectivament, i el complex XRCC4-ADN lligasa IV estimula la lligadura dels extrems de l'ADN (Chatterjee et al., 2015). L'enzim de processament dels extrems de l'ADN, també conegut com a polinucleòtid cinasa 3'-fosfat, és un enzim de processament dels extrems de l'ADN. Pot eliminar el grup 3'P de l'ADN i fosforilar el grup 5'OH durant la reparació de la DSB. També implica la reparació de trencaments de cadena simple (SSB) utilitzant la via de reparació SSB (Chatterjee et al., 2015). La proteïna quinasa DNA-PKcs és una proteïna quinasa dependent d'ADN que consisteix en una subunitat catalítica de la família de PIKK (cinases relacionades amb la fosfatidilinositol 3-cinasa) i atàxia telangiectàsia mutada (ATM), així com ATR relacionats amb ATM i Rad3, trencaments de cadena simple (DSB) i trencaments de cadena simple (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
La HDR és un mecanisme de reparació més precís i adequat perquè la informació es copia utilitzant la forma intacta del dúplex d'ADN homòleg, tot i que requereix la presència de cromàtides germanes. Això passa durant la fase S/G2 del cicle cel·lular dels mamífers. La HDR es produeix principalment en espècies de llevats, però la NHEJ és crítica en els mamífers (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). El mecanisme de reparació complet es mostra a la Figura 1.
Com que el tumor tumoral trigeminal (TNBC) està causat per anomalies genètiques i epigenètiques, la correcció d'anomalies genòmiques/epigenòmiques malignes mitjançant CRISPR/Cas9 pot ser un enfocament terapèutic raonable (Chen et al., 2019). A més, alguns factors de transcripció implicats en la regulació transcripcional específica de cèl·lules poden presentar característiques úniques de les cèl·lules canceroses, cosa que suggereix que la regulació transcripcional pot ser un enfocament excel·lent per al tractament del càncer (Drost et al., 2017). L'explotació d'aquestes característiques moleculars dels tumors, com ara defectes genètics, epigenètics i transcripcionals, per al desenvolupament de fàrmacs pot millorar els resultats clínics i reduir els costos de cribratge. CRISPR és una eina potencial d'edició de gens que no només pot detectar i identificar dianes genòmiques causants de càncer, sinó que també es pot utilitzar per editar, suprimir i modificar epigenèticament oncogens en cèl·lules humanes (Taula 1) (Ahmed et al., 2021). S'han dut a terme diverses proves de cribratge CRISPR per buscar gens associats amb supressors tumorals, oncogens i resistència als fàrmacs. L'ús de CRISPR/Cas9 per editar diversos oncogens de TNBC es mostra a la Figura 2.
Figura 2. Edició gènica de diversos oncogens de TNBC mitjançant CRISPR/Cas9 que resulta en una reducció del creixement tumoral i la metàstasi. Aquests oncogens inclouen CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 i CXCR7, Crypto1, ROR1 i ST8SIA, que estan implicats en l'aparició i la metàstasi del TNBC.
La migració, la invasió i la transició epitelial-mesenquimal (TEM) de les cèl·lules canceroses estan associades amb ITGA9. Estudis previs han demostrat que ITGA9 és un actor clau en la via Notch i juga un paper interessant en la metàstasi del rabdomiosarcoma (Molist et al., 2020). A més, es va trobar que ITGA9 estava estretament associat amb el pronòstic del pacient en diversos tipus de tumors, inclòs el càncer de mama (Wang Z. et al., 2019). A més, l'anàlisi bioinformàtica d'ITGA9 va mostrar que la seva expressió en el TNBC era significativament més alta que en altres subtipus de càncer de mama. Els nivells elevats d'ITGA9 s'associen amb metàstasi tumoral i recaiguda en pacients amb TNBC. L'eliminació d'ITGA9 per CRISPR/Cas9 va donar lloc a propietats similars a les cèl·lules mare del càncer (CSC), angiogènesi tumoral, creixement tumoral i reducció de la metàstasi mitjançant la promoció de la degradació de la β-catenina en el TNBC (Wang Z. et al., 2019).
La Crypto-1 és un membre de la família TGF-β i és fonamental per a l'embriogènesi primerenca, el manteniment de les cèl·lules mare i la metàstasi del càncer (Ishii et al., 2021). També coneguda com a Tdgf-1, és una proteïna de senyalització oncogènica ancorada a GPI implicada en la regulació de la formació de la línia primitiva, el mesoderma i l'endoderma, així com l'establiment de l'asimetria esquerra/dreta en el desenvolupament dels òrgans del cos durant l'embriogènesi (Zhang et al., 2021b). A més, s'ha demostrat que la Cripto-1 està implicada en la transició epitelial-mesenquimal (TEM) com a marcador de cèl·lules mare (Zhang et al., 2021b). La EMT és fonamental no només per a diversos processos com el desenvolupament embrionari, la fibrosi i la cicatrització de ferides, sinó també per a la invasió i la metàstasi del càncer. A més, s'ha demostrat que la Cripto-1 interactua amb quatre receptors Notch i millora la seva maduració posttraduccional (Brandstadter i Maillard, 2019). Se sap que la via de senyalització Notch està implicada en el manteniment de cèl·lules de càncer de mama humanes. Els estudis han demostrat que la supressió de Crypto-1 mediada per CRISPR/Cas9 suprimeix el creixement i la metàstasi del càncer. Per tant, Crypto-1 pot convertir-se en una diana terapèutica important per al TNBC (Castro et al., 2015).
La proteïna XCL12 i el seu receptor de quimiocines CXC (CXCR4 i CXCR7) tenen diversos papers en la proliferació, el creixement, la migració i la invasió de les cèl·lules canceroses (Wu et al., 2015). Aquests quimioreceptors s'han associat amb el desenvolupament del càncer de mama trigemina (TNBC) a través de múltiples vies de senyalització tant en models in vivo com in vitro (Wu et al., 2015). A més, l'activació de CXCR4 i CXCR7 s'associa amb una major susceptibilitat a la metàstasi i un mal pronòstic en el TNBC (Karn et al., 2022). Per tant, la supressió de CXCR4 i CXCR7 pot convertir-se en gens diana farmacològics eficaços per al tractament del càncer de mama, inclòs el TNBC. Un estudi de Yang et al. Yang et al (2019) va utilitzar CRISPR/Cas9 per suprimir conjuntament els gens CXCR4 i CXCR7 i va trobar que la proliferació, el creixement, la migració i la invasió del TNBC s'inhibien significativament (Yang et al., 2019).
Es van observar nivells elevats de miR-3662, un oncogen de cèl·lules TNBC, en teixits de càncer de mama (Yi et al., 2022). S'ha demostrat que la inhibició de miR-3662 inhibeix el creixement i la metàstasi del tumor de càncer de mama tant in vivo com in vitro (Agarwal i Gupta, 2021). L'HBP-1 és un potent inhibidor de la senyalització Wnt/-catenina i probablement és responsable del creixement de cèl·lules TNBC mediat per miR-3662. Recentment, Yi et al. van descobrir que l'eix miR-3662-HBP1 regula la via de senyalització Wnt/-catenina en cèl·lules TNBC (Yi et al., 2022). A causa de la seva expressió específica del tumor, miR-3662 pot ser una diana terapèutica potencial per a TNBC. Per tant, la inhibició de miR-3662 mediada per CRISPR/Cas9 pot ser un enfocament excel·lent per desenvolupar nous fàrmacs per al tractament de TNBC.
La UBR5 és una nucleofosfoproteïna de 300 kDa que s'ha identificat com a regulador clau de la tumorigènesi, la metàstasi i la resposta immunitària en diversos càncers (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). S'ha informat que la UBR5 està altament regulada a l'alça en mostres de TNBC i estimula la funció ERα induint la proliferació a través de la seva activitat ubiquitina lligasa (Bolt et al., 2015). Els estudis de seqüenciació de l'exoma complet de mostres de TNBC primàries també van mostrar una major expressió de la UBR5, cosa que suggereix el seu paper en el desenvolupament del TNBC. A més, la deleció de la UBR5 impulsada per CRISPR/Cas9 va mostrar una inhibició significativa de la metàstasi i el creixement del TNBC en models experimentals de ratolí. A més, la inclusió de la UBR5 en un model de ratolí de tipus salvatge va restaurar la seva funcionalitat completa, mentre que aquest efecte no es va observar en soques mutants inactivades (Liao et al., 2017). La manca d'UBR5 s'associa amb un augment de l'apoptosi, la necrosi i la inhibició del creixement tumoral en els TNBC a causa d'una angiogènesi deficient. A causa de la pèrdua d'UBR5, la propagació tumoral a òrgans distants es redueix i l'UBR5 indueix una EMT anormal principalment reduint l'expressió d'E-cadherina (Zhang i Weinberg, 2018). Recentment, s'ha demostrat que l'UBR5 és un factor molt important en la transcripció de PDL1 induïda per IFN-γ en els TNBC a causa de la seva manca d'activitat d'ubiquitinació d'E3. L'anàlisi del transcriptoma d'ARN va revelar que l'UBR5 pot tenir efectes sistèmics sobre els gens associats amb la via IFN-γ i promoure la transactivació de PDL1 augmentant els nivells d'activació de l'ARN de la proteïna quinasa (PKR) i els seus transductors i activadors de senyal de la transcripció 1 (STAT1) i del factor regulador d'interferó 1 (IRF1). Tanmateix, l'ablació combinada de l'expressió d'UBR5 i PD-L1 mediada per CRISPR/Cas9 té un efecte terapèutic sinèrgic que qualsevol dels dos bloquejos per si sol, amb efectes profunds sobre el microambient tumoral (Wu et al., 2022). Per tant, CRISPR/Cas9 pot ser una eina important per inhibir la funció d'UBR5, suprimint així la metàstasi dels TNBC i el creixement tumoral.
ROR1 és una proteïna transmembrana de tipus I que s'expressa durant el càncer i el desenvolupament embrionari i s'ha identificat com una proteïna oncofetal (Nicholas Borcherding, 2014). El comportament invasiu de diversos càncers humans s'associa amb la sobreexpressió de ROR1. S'han obtingut resultats prometedors d'estudis in vivo i in vitro que impliquen compostos terapèutics dirigits a ROR1 (Chien et al., 2016). Els nivells elevats d'ARNm de ROR1 en biòpsies de teixit mamari també s'han associat amb tumors de mama basals (BL) agressius i la seva migració a altres parts del cos. A més, la sobreexpressió de ROR1 s'ha identificat com un marcador pronòstic per al desenvolupament de TNBC (Chien et al., 2016). Tanmateix, silenciar ROR1 mitjançant CRISPR/Cas9 per suprimir el creixement i la metàstasi de TNBC seria una estratègia eficaç.
El procés de sialilació implica l'addició d'àcid siàlic als glicoconjugats, que és catalitzat per sialiltransferases (ST). ST8SIA1 pertany a la família ST i juga un paper important en la patogènesi de diverses malalties com la leucèmia limfocítica i el càncer colorectal (Chang et al., 2018). L'anàlisi de la seqüència d'ARN mostra que ST8SIA1 s'expressa altament en el teixit mamari de pacients amb TNBC i està positivament correlacionat amb mutacions en el gen supressor tumoral p53, que poden contribuir a la patogènesi del TNBC (Battula et al., 2017). A més, ST8SIA1 està implicat en la metàstasi i la recurrència del TNBC, cosa que suggereix que juga un paper important en l'aparició i el desenvolupament del TNBC. En un model in vitro de TNBC, es va demostrar que la inhibició de ST8SIA1 per CRIPSR/Cas9 bloqueja el creixement i la metàstasi (Battula et al., 2017). Això suggereix que CRISPR/Cas9 pot ser una eina important per inhibir la funció de l'oncogen ST8SIA1 en el tractament del TNBC.
El NAT1 és un enzim metabòlic que catalitza la formació de compostos xenobiòtics de fase II i s'expressa en gairebé tots els teixits humans. El NAT1 pot utilitzar el cofactor folat per atacar l'acetil-CoA (acetil-CoA) fins i tot en absència del substrat d'amina aromàtica (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Els estudis han demostrat que el NAT1 regula la funció de la metal·loproteinasa matricial 9 (MMP9) en models de cèl·lules de càncer de mama i protegeix contra les espècies reactives d'oxigen (ROS) durant la inanició de glucosa (Wang et al., 2018). S'ha demostrat que l'eliminació del NAT1 inhibeix el complex de la piruvat deshidrogenasa, cosa que provoca una disfunció mitocondrial (Wang L. et al., 2019). A més, diversos altres informes han demostrat que la inhibició del NAT1 mitjançant molècules petites i el silenciament de siRNA pot reduir la invasió i la proliferació de les cèl·lules de càncer de mama (Stepp et al., 2018). Recentment, s'ha utilitzat CRISPR/Cas9 per suprimir NAT1 a la línia cel·lular de càncer de mama MDA-MB-231, cosa que afecta el metabolisme cel·lular en funció del seu nivell d'expressió. Aquest estudi també ha demostrat que NAT-1 és fonamental per a la progressió i la metàstasi del càncer de mama trigemina (TNBC) (Carlisle et al., 2020).
La transcripció coordinada d'oncogens està regulada per superpotenciadors, factors de transcripció i cofactors (Hnisz et al., 2015). A més, un grup de cinases dependents de ciclines (CDK), com ara CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 i CDK13, són necessàries per a la regulació transcripcional. Entre elles, CDK7 està implicada en la fosforilació de l'ARN polimerasa II, que és molt important per a la iniciació i l'expansió de la transcripció d'oncogens en la patogènesi del TNBC. En un estudi seminal, la deleció de CDK7 per CRISPR/Cas9 va inhibir el TNBC, cosa que indica que la patogènesi del TNBC depèn de CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Estudis han demostrat que les mutacions en MYC i RBP (proteïna d'unió a ARN) poden conduir a l'apoptosi, mentre que les mutacions d'un sol gen en MYC o RBP no afecten el creixement de les cèl·lules canceroses (Einstein et al., 2021). S'han analitzat més de 1000 RBP del genoma humà mitjançant una biblioteca basada en CRISPR/Cas9. D'entre elles, es va trobar que 57 RBP són crítiques per al creixement de cèl·lules canceroses amb nivells de MYC molt elevats (Wheeler et al., 2020). A més, YTHDF2 és important per mantenir el creixement de les cèl·lules TNBC i redueix la quantitat de transcrits metilats durant la transcripció i la traducció d'alt nivell en cèl·lules canceroses amb una expressió de MYC més alta. A més, YTHDF2 no és essencial per a les cèl·lules canceroses, que són menys dependents dels nivells elevats de MYC per prolongar la supervivència dels pacients amb TNBC (Einstein et al., 2021), cosa que suggereix que pot ser una diana terapèutica potencial per a fàrmacs que poden superar TNBC.
Les proteïnes amb dits de zinc (ZNF) constitueixen aproximadament l'1% del genoma humà total. Estudis han demostrat que el ZNF pot regular la proliferació cel·lular en diversos càncers, com ara el càncer de fetge, el càncer de mama i el càncer colorectal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Les biblioteques generades per la supressió de CRISPR s'han utilitzat per cribrar diversos gens supressors de tumors (TSG) en cèl·lules de càncer de mama (Shalem et al., 2014). Des de llavors, un estudi transcriptòmic de cèl·lules de càncer de mama amb deleció de ZNF319 en CRISPR/Cas9 ha demostrat que el ZNF319 és un gen supressor de tumors que redueix la proliferació del càncer de mama i, per tant, està implicat en diversos mecanismes de senyalització potencials i altres funcions biològiques (Wang L. et al., 2022).
La ferroptosi és un tipus de mort cel·lular programada que depèn de la presència de ferro. Se sap que el desenvolupament de la ferroptosi està influenciat per la presència de peròxids lipídics. A més, s'ha informat que la PKCβII presenta una peroxidació lipídica primerenca, i l'augment de la peroxidació lipídica s'associa amb la ferroptosi. La selecció d'una biblioteca d'inhibidors de cinasa mediats per CRISPR/Cas9 va revelar que la PKCβII està implicada en el procés de peroxidació lipídica, que és crítica per a la ferroptosi en cèl·lules MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Per tant, això suggereix que la supressió de la PKCβII per CRISPR/Cas9 pot ser una possible diana gènica supressora de tumors per al tractament de malalties relacionades amb la ferroptosi (Zhang et al., 2022).
Es creu que la resistència als fàrmacs és responsable d'aproximadament el 90% de les morts en pacients amb càncer i és un dels principals reptes en el tractament del càncer (Bukowski et al., 2020). Els resultats indiquen que un nombre suficient de gens relacionats amb l'expulsió de fàrmacs, la reparació de l'ADN, l'apoptosi i diverses vies de senyalització cel·lular estan associats amb la resistència als fàrmacs (Haider et al., 2020). Entre ells, diversos gens han estat objectiu de les eines CRISPR/Cas9 i han mostrat resultats prometedors en la reducció de la resistència als fàrmacs i l'augment de l'eficàcia dels tractaments contra el càncer (Vaghari-Tabari et al., 2022). A més, les biblioteques de cribratge d'alt rendiment per a la eliminació del gen CRISPR/Cas9 s'han implicat en la modificació de la funció de possibles dianes gèniques de resistència als fàrmacs (Shalem et al., 2015). Per identificar gens de resistència al paclitaxel, es va utilitzar la seqüenciació d'ARN juntament amb el cribratge de biblioteques de sgRNA de tot el genoma per identificar vuit gens candidats, inclosa la histona desacetilasa 9 (HDAC9), que estan associats amb la resistència als fàrmacs en pacients amb TNBC recurrent (B et al., 2020). En un altre estudi, es va observar una major expressió de la diserina/treonina i la tirosina proteïna quinasa (DSTYK) durant la supervivència de pacients amb TNBC tractats amb fàrmacs anticancerígens. A més, la inhibició de DSTYK mediada per CRISPR/Cas9 va augmentar significativament l'apoptosi de les cèl·lules canceroses resistents als fàrmacs in vitro (cèl·lules SUM102PT i cèl·lules MDA-MB-468) i un model de TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Tot i que el TNBC té una activació anormal de la via MAPK, l'efecte clínic de les teràpies dirigides a MEK és deficient. Una selecció de la biblioteca genòmica CRISPR/Cas9 va revelar que la inhibició de PSMG2 (xaperona 2 de l'assemblatge del proteoma) sensibilitza les cèl·lules TNBC BT549 i MB468 a l'inhibidor de MEK AZD6244. La inhibició de PSMG2 per CRISPR/Cas9 va alterar la funció normal del proteasoma, cosa que va conduir al desassemblatge mediat per autofàgia de PDPK1, millorant així encara més les cèl·lules tumorals en models de ratolí TNBC induïts per AZD6244 (inhibidor de MEK) i MG132 (inhibidor del proteasoma). Per tant, els inhibidors del proteasoma i de la cinasa MAP (MEK) es poden administrar sinèrgicament per reduir la proliferació de cèl·lules tumorals (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 també s'ha utilitzat per detectar la pèrdua de funció gènica que condueix a la resistència al TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. van explicar el mecanisme de resistència als fàrmacs de les cèl·lules canceroses tractades amb JQ1, un inhibidor del bromodomini BET (BBDI), en el TNBC. Utilitzant CRISPR/Cas9, van descobrir que l'eliminació del gen rb1 feia que el TNBC es tornés resistent al fàrmac anticancerígen JQ1. Per tant, la funció rb1 és important en la resposta als fàrmacs JQ1 en el TNBC. També van informar que el paclitaxel és un inhibidor de la cinasa/microtúbuls CDK4/6, i la seva combinació amb BBDI com el JQ1 pot proporcionar respostes terapèutiques prometedores al TNBC resistent als fàrmacs (Ge et al., 2020).
S'ha informat que el paisatge transcripcional de l'ARN llarg no codificant (lncRNA) és responsable de la resistència a la teràpia neoadjuvant en el TNBC. Aquest estudi mostra que cinc transcrits diferents de lncRNA de MALAT1 s'expressen altament en el TNBC. A més, la deleció de MALAT1 mediada per CRISPR/Cas9 va augmentar la sensibilitat de les cèl·lules TNBC BT-549 al paclitaxel i la doxorubicina, cosa que suggereix un possible paper per a la resistència a MALAT1 en el TNBC (Shaath et al., 2021).
Les mutacions en BRCA1 (BRCA1m) són heterogènies i, per tant, difícils de detectar. La focalització de PARP1 (poli(ADP-ribosa) polimerasa), la parella letal sintètica de BRCA1, pot augmentar la quimiosensibilitat als fàrmacs del TNBC. Mitjançant CRISPR/Cas9, la deleció de PARP1 va augmentar la sensibilitat dels fàrmacs anticancerígens com la doxorubicina, la gemcitabina i el docetaxel a les cèl·lules TNBC mutants de mBRCA1, cosa que suggereix que PARP1 també està implicada en la resistència als fàrmacs en el TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Se sap que les mutacions en els gens supressors tumorals BRCA1 o BRCA2 augmenten la probabilitat de desenvolupar càncer de mama en les persones. El tractament d'aquestes pacients requereix l'ús d'inhibidors de PARP. A més, s'ha demostrat que l'eliminació del factor de recuperació de nucleòtids DNPH1 mitjançant CRISPR/Cas9 pot eliminar el nucleòtid tòxic 5-hidroximetildesoxiuridina (hmdU) monofosfat, millorant així la resposta de les cèl·lules amb deficiència de BRCA a la sensibilitat als inhibidors de PARP (Fugger et al., 2021). Per tant, els inhibidors de CRISPR/Cas9 i PARP1 poden convertir-se en una estratègia de tractament important per al TNBC.
El gen de la glicoproteïna penetrant (P-gp) és un gen de resistència a múltiples fàrmacs que generalment està regulat a l'alça en aproximadament el 41% de tots els TNBC (Sun et al., 2020). L'expulsió de fàrmacs induïda per P-gp s'ha identificat com un regulador clau de la resistència als fàrmacs en el càncer de mama. Els inhibidors de la P-gp han demostrat una major sensibilitat als fàrmacs anticancerígens en el càncer de mama (Famta et al., 2021). Per tant, l'ablació o supressió mediada per CRISPR/Cas9 de la P-gp i els inhibidors de la P-gp poden ser mètodes molt importants per superar la resistència als fàrmacs en el TNBC.
Se sap que el transportador de cassette d'unió a ATP G2 (ABCG2) causa resistència als fàrmacs en el TNBC (Palasuberniam et al., 2015), tot i que actualment no hi ha informes sobre la relació entre el silenciament de CRISPR/Cas9 i ABCG2 i la inactivació del gen supressor de tumors. El PTEN pot augmentar l'activació d'ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Per tant, l'ús de CRISP/Ca9 per eliminar ABCG2 i combinar-lo amb un inhibidor d'ABCG2 pot ser un tractament adequat per superar la resistència als fàrmacs en el TNBC. La Taula 2 esmenta CRISPR/Cas9 dirigit a tots els gens de resistència.
Taula 2. CRISPR/Cas9 té com a objectiu diversos gens de resistència als TNBC per sensibilitzar les cèl·lules als fàrmacs anticancerígens.
Les biblioteques CRISPR/Cas9 són eines potencials per al cribratge de mutacions gèniques associades amb la patogènesi del càncer (Chan et al., 2022). Aquest mètode de cribratge implica quatre passos, com ara (a) construcció de biblioteques, (b) transducció lentiviral, (c) cribratge fenotípic i (d) anàlisi del gen diana. Tot i que el TNBC té una activació anormal de la via MAPK, el pronòstic clínic de la teràpia dirigida a MEK per a pacients amb TNBC portadors de mutacions en gens supressors de tumors com ara PTEN, RB1 i TP53 és molt dolent.
A més, una prova de detecció de gens mitjançant CRISPR/Cas9 va provar la molècula més potent i selectiva, el deshidrocatrol, que és abundant en els extractes de flors i fulles de Guatemala, per comprendre l'efecte del deshidrocatrol sobre l'MDA-MB-231. Mecanismes de citotoxicitat cel·lular selectiva. Característiques de la tija mesenquimal dels subtipus de TNBC. Aquesta prova basada en CRISPR/Cas9 també va revelar que l'HSD17B11, un gen que codifica la 17β-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipus 11, s'expressa molt en cèl·lules MDA-MB-231 i dóna lloc a deshidrofalcarinol específic per a les cèl·lules MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Per tant, això suggereix que la prova de detecció genòmica de CRISPR/Cas9 té un gran potencial per identificar els mecanismes subjacents a les propietats anticancerígenes de possibles compostos naturals.
A més, es va estudiar la vulnerabilitat del TNBC al càncer mitjançant un cribratge CRISPR/Cas9 in vivo imparcial a nivell del genoma, que va mostrar un vincle entre les vies oncogèniques i les supressores de tumors. S'ha informat que els components clau de les vies mTOR i Hippo tenen un paper important en la regulació tumoral en el TNBC. A més, els estudis han demostrat que la inhibició farmacològica de l'oncoproteïna mTORC1/2 i YAP inhibeix eficaçment la patogenicitat del TNBC mitjançant un model de sinergia fàrmac-matriu in vitro i xenografts derivats de pacients in vivo. A més, la inhibició de mTORC1/2 mediada per Torin-1 millora la macropinocitosi, mentre que la inhibició de YAP induïda per verteporfina condueix a la mort cel·lular del TNBC. En conjunt, aquests resultats destaquen la potència i la robustesa del cribratge CRISPR in vivo a nivell del genoma per identificar tractaments nous i eficaços per al TNBC (Dai et al., 2021).
La desregulació del sistema immunitari és un factor important en la tumorogènesi. Les cèl·lules canceroses eviten l'eliminació immunitària evitant els mecanismes de defensa, com ara interferir amb l'activitat de les cèl·lules immunitàries en el microambient tumoral i comprometre el sistema immunitari. Per tant, desenvolupar un sistema immunitari millorat pot ser un enfocament clau per combatre els tumors. L'ús de la modificació gènica basada en CRISPR/Cas9 aborda diversos problemes relacionats amb la disfunció immunitària des de diferents perspectives. CRISPR/Cas9 s'ha utilitzat per millorar la immunitat antitumoral contra el càncer de mama a través de les vies següents (Figura 3).
Figura 3. La immunoteràpia CRISPR/Cas9 té com a objectiu les cèl·lules TNBC. La pèrdua de CDK5 i la supressió de PDL1 i CD155 milloren el sistema immunitari. De la mateixa manera, la pèrdua d'A2AR i la supressió de TAA com ara HER2, mucina 1 i TEM8 van augmentar l'eficiència de les cèl·lules CAR-T en la destrucció de cèl·lules canceroses. El cribratge de cèl·lules T impulsat per CRISPR/Cas9 ha demostrat que la disrupció de la cinasa p38 millora l'activitat antitumoral de les cèl·lules T. Les cèl·lules T modificades per CRISPR/Cas9 augmenten l'expressió de TCR (receptor de cèl·lules T), donant lloc a cèl·lules T amb activitat antitumoral.
L'objectiu de la immunoteràpia és estimular el sistema immunitari perquè ataqui les cèl·lules canceroses. La sobreexpressió de proteïnes de punts de control immunitari normalment prevé les reaccions autoimmunitàries, però pot ajudar els càncers a evitar-les (Topalian et al., 2015). Aquestes proteïnes prevenen les reaccions immunitàries unint-se a receptors a la superfície de les cèl·lules immunitàries. Múltiples proteïnes de punts de control (com ara CD155 i PD-L1) es dirigeixen al receptor PD-1 a les cèl·lules immunitàries i s'expressen en el càncer de mama, especialment el TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). La inhibició de PD-L1 o del seu receptor mitjançant CRISPR/Cas9 pot estimular el sistema immunitari perquè ataqui els tumors TNBC (Yahata et al., 2019). A més, s'ha demostrat que la regulació a la baixa de l'expressió de PD-L1 mitjançant l'eliminació de CDK5 mediada per CRISPR/Cas9 inhibeix el creixement tumoral in vitro i in vivo (Deng et al., 2020). La inhibició del creixement en models in vitro i in vivo de càncer de mama suggereix que la reducció de CD155 mediada per shRNA pot tenir un efecte terapèutic sobre el càncer de mama (Gao et al., 2018).
Els limfòcits T CAR expressen CAR que reconeixen antígens associats a tumors (TAA) i poden utilitzar la supressió de proteïnes de punt de control per millorar la seva activitat (Li C. et al., 2020). Hi ha diverses dianes potencials per a la teràpia amb limfòcits T CAR en el càncer de mama, incloent-hi diversos TAA com ara HER2, mucina1 i TEM8 (Bajgain et al., 2018). Hi ha proves que els limfòcits T CAR dirigits a la mesotelina (sobreexpressats en cèl·lules TNBC BT-459) són més eficaços contra el càncer quan s'elimina PD-1 mitjançant CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Tanmateix, aïllar els limfòcits T dels pacients i després editar-los ex vivo és un procés que requereix molta mà d'obra i molt de temps. Tot i que els limfòcits T universals poden reduir els requisits d'aïllament, els limfòcits T donants que expressen l'antigen leucocitari humà (HLA classe I) i el receptor de limfòcits T (TCR) s'han d'eliminar per evitar anomalies de l'empelt contra l'hoste (Ren et al., 2017, 2017a). Utilitzant CRISPR/Cas9, l'HDR pot eliminar simultàniament TCR i HLA i eliminar el gen que codifica CAR. Els estudis han demostrat que CRISPR/Cas9 es pot utilitzar per introduir CAR anti-CD19 al locus TCR, produint així CAR eficientment sense esgotar els limfòcits T (Dimitri et al., 2022). S'han desenvolupat tecnologies multiplex per generar limfòcits T CAR al·logènics eliminant simultàniament TCR, beta-2-microglobulina (B2M), subunitat HLA-I i altres proteïnes com PD-1 i CTLA-4, que poden tenir majors propietats anticancerígenes contra el TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
L'ús de CRISPR/Cas9 podria millorar l'eficàcia de les cèl·lules CAR-T. Se sap que l'adenosina té propietats immunosupressores i pot reduir la immunitat anticancerígena bloquejant la funció de les cèl·lules T i activant els receptors d'adenosina A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Silenciar l'A2AR mitjançant CRISPR/Cas9 va millorar significativament l'eficàcia de les cèl·lules CAR-T in vivo (Giuffrida et al., 2021). Se sap que les cèl·lules T presenten diverses característiques fenotípiques com l'expansió cel·lular, la diferenciació, l'estrès oxidatiu i l'estrès genòmic. El cribratge de cèl·lules T basat en CRISPR/Cas9 va revelar la disrupció de 25 cinases receptores de cèl·lules T diferents. Entre elles, s'ha demostrat que la deleció de la cinasa p38 millora l'activitat antitumoral de les cèl·lules T, cosa que indica que la cinasa p38 és un regulador clau de la regulació de les cèl·lules CAR-T (Gurusamy et al., 2020).
Els limfòcits T es poden modificar genèticament mitjançant CRISPR/Cas9 per produir TCR altament expressats. La transferència de limfòcits T modificats genèticament als pacients ha demostrat una activitat anticancerígena més forta que els limfòcits T endògens. Per tant, els TCR endògens poden competir amb els TCR alterats genèticament en els pacients, cosa que pot afectar el potencial de la immunoteràpia contra el càncer. Per superar aquest problema, l'ús de CRISPR/Cas9 per eliminar els TCR-β endògens a les cèl·lules receptores i posteriorment transferir limfòcits T TCR-β a pacients amb càncer pot presentar millors respostes immunitàries anticancerígenes sense necessitat de competència sexual endògena per TCR (Fan et al. 2018). Així, amb l'excepció dels limfòcits T modificats per CRISPR, els TCR són mil vegades més sensibles als antígens tumorals que els limfòcits T transduïts per TCR normals. A més, en diverses leucèmies, els limfòcits T alterats generats per γδ TCR+ CRISPR presenten una expressió més alta de limfòcits T CD4+ i CD8+ que la transferència estàndard de TCR (Legut et al., 2018). Per tant, els limfòcits T modificats generats per CRISPR/Cas9 poden ser un mètode d'immunoteràpia eficaç per superar el TNBC.
Les integrines són molècules d'adhesió cel·lular presents a les transmembranes cel·lulars i promouen la unió de les cèl·lules a la matriu extracel·lular (MEC) (Hamidi i Ivaska, 2018). La desregulació de les integrines s'associa amb el desenvolupament i la migració del càncer mitjançant l'alteració de la matriu extracel·lular, la qual cosa condueix a la supervivència de les cèl·lules canceroses a la circulació (Hamidi i Ivaska, 2018). La supressió de la integrina mediada per CRISPR/Cas9 alenteix la progressió tumoral, la metàstasi i la colonització en el càncer de trigeminació (TNBC). S'ha informat que la supressió de la integrina a5 (ITGA5) redueix la migració i la progressió cel·lular en altres càncers com el càncer de pulmó (Ju et al., 2017), cosa que suggereix que la integrina a5 també pot ser un factor clau en la patogènesi del TNBC.
La generació de ratolins knockout mitjançant mètodes tradicionals de cèl·lules mare embrionàries (ES) és un procés que requereix molta mà d'obra, molt de temps i és ineficient. Es necessiten mesos i anys per dirigir-se a les cèl·lules ES mitjançant la recombinació homòloga, criar ratolins quimèrics i després creuar-los amb ratolins heterozigots per produir descendència homozigota. Es requereix un encreuament complex per crear ratolins amb múltiples mutacions genètiques. Tanmateix, han sorgit molts problemes quan s'utilitzen ratolins generats per ablació de cèl·lules ES mitjançant CRISPR/Cas9 o mitjançant la microinjecció de components CRISPR/Cas9 en òvuls fecundats d'una sola cèl·lula. Per exemple, la introducció de canvis sovint es produeix en loci bial·lèlics i no és específica de gen. Recentment s'ha informat que les cèl·lules ES que utilitzen la tecnologia CRISPR/Cas9 poden inserir simultàniament mutacions bial·lèliques en fins a 5 gens (Nishizono et al., 2021). Per a aquest propòsit, es va transfectar simultàniament l'ARNm de Cas9 i cinc gRNA específics de gens en cèl·lules ES. Això destaca la promesa i l'eficàcia d'aquest procediment, tot i que aquestes mutacions poden haver-se transmès quan es van creuar línies fundadores per produir ratolins quíntuple knockout. L'estudi també informa d'un descobriment sorprenent: les cèl·lules ES ja no són necessàries per crear ratolins modificats genèticament. En canvi, per eliminar productes gènics específics, es va injectar mRNA i gRNA Cas9 en embrions en fase unicel·lular. Com a resultat, s'han creat línies fundadores knockout que teòricament es poden utilitzar per estudiar les conseqüències de la deleció de gens en ratolins (Qin et al., 2016). Així, CRISPR/Cas9 permet la creació de ratolins transgènics per tractar el TNBC a un cost inferior a l'enginyeria genètica tradicional. Utilitzant el sistema CRISPR/Cas, s'ha desenvolupat un nou model de ratolí knockout que pot introduir amb èxit mutacions puntuals en un o més gens endògens en el TNBC. Basant-se en aquest concepte, també es poden desenvolupar models animals de TNBC mitjançant l'eliminació mediada per CRISPR/Cas9 de BRCA1 i p53, la qual cosa provoca la pèrdua de la reparació de HR, inestabilitat genòmica i fenotips mutants (Annunziato et al., 2020).
Actualment, s'utilitzen diversos mètodes com la mamografia, la ressonància magnètica (RM) i l'ecografia per diagnosticar el càncer de mama trigeminat (CMTN). Tanmateix, aquests mètodes tenen algunes limitacions. La mamografia s'utilitza per diagnosticar teixit mamari local en lloc de metàstasis, on les cèl·lules canceroses han migrat a altres òrgans. L'ecografia no és un mètode fiable per diagnosticar el CMTN (Chen i Lee-Felker, 2023). La RM té una sensibilitat més alta que l'ecografia i la mamografia, però la seva precisió diagnòstica és limitada (Sha i Chen, 2022). La biòpsia de teixit és una manera invasiva d'identificar cèl·lules canceroses. Tanmateix, en alguns casos, una biòpsia pot passar per alt teixit cancerós si l'agulla s'allunya de la zona d'interès. A més, és molt cara i pot ser traumàtica per a la pacient. El CMTN és un tipus de càncer heterogeni, per la qual cosa una biòpsia pot no proporcionar prou informació sobre el tipus de càncer. Per tant, es necessita urgentment un nou mètode diagnòsticament fiable per detectar el CMTN. CRISPR/Cas9 pot servir com una alternativa altament sensible i mínimament invasiva per al diagnòstic del càncer de mama. Amb aquesta finalitat, les estratègies basades en CRISPR/Cas9 es poden utilitzar per millorar els mètodes de PCR per al diagnòstic de TNBC. Primer, les proteïnes Cas9 i cpf1 del sistema CRISPR s'utilitzen per eliminar l'ADN no específic, i després aquestes dues proteïnes (Cas9 i cpf1) poden reconèixer la seqüència PAM abans d'unir-se a l'ADN diana (Deepak Singh et al., 2021). Així, la PCR pot identificar mutacions associades amb el desenvolupament del càncer. Diversos estudis han adoptat aquesta estratègia basada en CRISPR per detectar diferents mutacions en diferents càncers (Safari et al., 2019). Per tant, els mètodes de PCR basats en CRISPR poden reduir la dependència del diagnòstic de TNBC de mètodes invasius com la immunohistoquímica basada en biòpsia.
També s'han demostrat canvis genotípics en la regulació dels receptors hormonals en el TNBC (Chen i Russo, 2009). Les estratègies de PCR basades en CRISPR/Cas9 que utilitzen microarrays per a diagnòstics en el punt d'atenció poden controlar eficaçment aquestes mutacions (Hajian et al., 2019). També podria proporcionar als professionals sanitaris informació rellevant sobre mutacions específiques en pacients amb TNBC, cosa que podria ajudar a millorar el seu curs de tractament. Tanmateix, aquesta tècnica combinada té limitacions. Per tant, calen grans esforços de recerca abans que aquest mètode CRISPR/Cas-PCR es pugui utilitzar en l'atenció mèdica per al diagnòstic del TNBC (Yang et al., 2019).